Rhumatologie Un seul changement d’acides aminés dans un motif hautement conservé de gp déclenche la neutralisation du VIH et protège contre l’appauvrissement de la DC

Un seul changement d’acides aminés dans un motif hautement conservé de gp déclenche la neutralisation du VIH et protège contre l’appauvrissement de la DC

ContexteL’induction d’anticorps neutralisants contre des régions conservées de la protéine de l’enveloppe du VIH du virus de l’immunodéficience humaine est un objectif majeur des stratégies vaccinales. Nous avons précédemment identifié S, un motif conservateur critique de gp qui induit le ligand NKpL d’un récepteur NK activant in vivo. Méthodes: Des substitutions spécifiques dans le motif peptidique S ont été préparées par mutagenèse dirigée. La production de virus a été surveillée en mesurant la production de p. Des dosages de neutralisation ont été effectués avec des anticorps immuno-purifiés provenant des anticorps anti-NK. L’expression de NKpL sur les cellules T CD et le test de dégranulation sur les cellules NK activatrices ont toutes deux été effectuées par cytométrie de flux. Ici, nous montrons que des substitutions spécifiques dans le motif S réduisent l’infection virale sans affecter la production de gp, tout en diminuant à la fois sa capacité à induire l’expression de NKpL sur les lymphocytes T CD et sa sensibilité aux cellules NK autologues Génération d’anticorps chez les souris contre la position spécifique W dans le motif S induit une capacité à neutraliser les virus cross-clade, remarquable par son ampleur, sa largeur et sa durabilité Des variants S ont également été détectés dans les sérums de certains patients infectés par le VIH, démontrant à la fois une activité de neutralisation et une protection contre la déplétion des CDConclusionsCes conclusions suggèrent qu’une substitution spécifique dans un immunogène à base de S pourrait permettre la production d’anticorps spécifiques. vaccin qui combine une capacité à neutraliser le VIH et à protéger les cellules T CD

VIH, activité neutralisante, déplétion des CD, cytotoxicité NK, vaccination NKpLPreventive reste la stratégie la plus efficace pour bloquer la propagation de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type VIH Bien que des vaccins à base de cellules T puissent être développés, des vaccins stimulant les cellules B Pour obtenir des anticorps neutralisants à réactivité croisée Les NAb restent un objectif majeur et non atteint Une large gamme de NAb a été identifiée, en relation avec des caractéristiques structurelles inhabituelles Plusieurs études importantes ont montré que des sérums provenant d’environ% des les patients ont des NAbs, et% d’entre eux sont des neutralisants d’élite avec une activité puissante contre la plupart des clades VIH La protéine ENV est extraordinairement variable, et ses éléments conservés insuffisamment immunogènes Les travaux en biologie structurale et mutagenèse suggèrent que gp est une cible environnement riche avec de nombreux sites potentiels pour l’intervention thérapeutique Nous avons montré que le motif S, situé entre les résidus – dans le g La région de la boucle p selon la position de gp de la souche BRU VIH, est remarquablement conservée et spécifique aux souches VIH. Ces caractéristiques indiquent que ce motif est probablement important pour la conformation et / ou la fonctionnalité du virus Ce mécanisme a été étudié au niveau cellulaire pour révéler que le motif S se lie à gCqR, le récepteur pour le domaine globulaire du facteur du complément Cq Cette interaction induit NKpL, le ligand cellulaire d’un récepteur NK naturel activateur NKp, rendant les cellules T CD L’expression de NKpL est fortement corrélée à la fois au déclin du nombre de cellules CD et à d’autres effets secondaires liés à la pathogénicité, à savoir l’activation des cellules T, l’inflammation et l’apoptose ex vivo chez les patients infectés par le VIH, et in vivo chez les macaques immunisés avec le motif S La perte de cellules T CD observée au cours de la phase chronique de l’infection par le VIH est principalement due à la mort de cellules bystander non infectées Nous avons trouvé que Nef, un Les résultats suggèrent que le VIH utilise les cellules NK pour désarmer le système immunitaire de l’hôte en déclenchant sélectivement la mort des cellules T CD non infectées. montrer ici, pour la première fois, que des substitutions spécifiques dans le motif S provoquent une activité largement neutralisante contre le VIH- Cette découverte fournit une base rationnelle pour la génération de NAbs et pour concevoir un vaccin contre le VIH qui suscite ces NAb et protège contre l’appauvrissement des CD

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Échantillons de plasma humain provenant de patients infectés par le VIH

Des plasmas ont été prélevés sur des volontaires infectés par le VIH à l’hôpital Pitié-Salpêtrière Paris, France Les participants éligibles ont été âgés de ≥ ans, infectés par le VIH pendant au moins des années avant le jour du dépistage et subissant une forte traitement antirétroviral actif Les échantillons plasmatiques ont été prélevés comme décrit précédemment , puis inactivés à la chaleur à ° C pendant quelques minutes avant les tests de neutralisation.

Préparation de virus

Des mutants ont été préparés à partir du plasmide pNL avec le kit de mutagénèse site QuickChange II XL Stratagene, puis vérifiés par séquençage d’ADN. Des plasmides S pNL de type sauvage et mutant alanine ont été transfectés par la lipofectamine Invitrogen dans des cellules T dans un milieu Optima surnageant cellulaire. a été récolté quelques heures après la transfection, et la concentration de p a été mesurée avec le kit Vidas Ag p II Les surnageants de bioMérieux Virus ont été congelés et stockés à – ° C

Peptides, anticorps et dosage immuno-enzymatique

L’hémocyanine purifiée non conjuguée et en trou de serrure KTH conjuguée à KLH , et la pureté des peptides synthétiques S mutés à l’alanine de chaque peptide>% ont été achetés chez Covalabs Villeurbanne, France Les séquences des peptides sont listées dans le tableau supplémentaire 6 Balb / c -week-old Des souris femelles ont reçu des injections sous-cutanées avec μg de peptide lié à la KLH dans un adjuvant incomplet de Freund, à quelques jours d’intervalle. Les sérums ont été prélevés le jour Les sérums ont été titrés par ELISA enzymatique, comme décrit précédemment

Test d’infection

Dix millions de cellules ont été incubées avec ng d’équivalents d’antigène p, pendant des heures, des cellules T CD activées primaires purifiées provenant de différents donneurs sains ou des cellules MT- et Jurkat à la production de virus ° C ont été surveillées tous les jours après l’infection en mesurant la formation de Syncytium. cellules MT infectées a été évaluée après des heures de microscopie à contraste de phase standard

Essai d’infectivité du VIH à cycle unique

Des cellules HeLa PC ont été ensemencées un jour avant et infectées avec ng p / mL de WT ou de virus mutés NL Au bout de quelques heures après l’infection, l’activité β-galactosidase a été mesurée dans des lysats cellulaires HeLa-PC avec le kit CPRG Beta-Galactosidase OZ Biosciences

ELISA quantitatif pour gp dans les particules du VIH

Des cultures de surnageants de cellules T transfectées contenant le virus ont été récoltées et clarifiées par filtration à travers un filtre de -μm. Les échantillons viraux ont été traités comme décrit , puis testés pour le kit p Vidas Agp II et Immunodiag Inc ELISA gp a été calculé comme le rapport des concentrations de gp et de p

Essais de neutralisation

Des fractions d’immunoglobulines G polyclonales d’antisérums de souris ont été isolées avec le kit Nab Protein A / G Spin et ensuite dessalées avec des colonnes de déstalage Zeba de Thermo Scientific. Les fractions d’immunoglobulines ont été concentrées avec des unités Centric centrifuges Millipore puis quantifiées avec le kit d’analyse protéique BCA Thermo Les immunoglobulines scientifiques purifiées ont été testées à des concentrations de départ de μg / mL, suivies de dilutions de cinq fois. Les ABS Humains ont été purifiés par immunoprécipitation avec du plasma inactivé par la chaleur provenant de patients infectés par le VIH; le kit Pierce Direct IP a été utilisé, et les peptides synthétiques WT et WA ont été directement immobilisés sur un support d’agarose réactif aux amines. Des anticorps purifiés ont été dialysés contre une cassette de dialyse Silde-A-Lyser, quantifiée puis testée au départ. La neutralisation de l’ABS purifié a été testée, comme décrit pour comparer les concentrations d’activité requises pour atteindre l’inhibition de% [IC] des ABS en présence d’une dose médiane infectieuse de culture tissulaire TCID avec un taux de dilution de 5%. test de CD-T p CD standard, et pour déterminer la capacité des ABS à inhiber l’entrée du VIH en utilisant à la fois les cellules HeLa-PC et Tzm-bl reporter Au heures après l’infection, l’activité β-galactosidase dans les lysats HeLa-PC a été mesurée. activité luciférase dans les lysats TZM-bl avec le réactif Britelite Plus Perkin Elmer ou le réactif Brite-lueur Promega Une valeur de coupure de l’arrière-plan a été appliquée pour déterminer les valeurs positives

Cytométrie en flux

Une analyse de tri cellulaire activée par fluorescence a été effectuée sur des cellules T CD purifiées comme décrit , en présence de μg d’anti-NKpL ou de protéines de fusion NKp-immunoglobuline [Ig], NKp-Ig ou NKp-Ig; Systèmes R & D pendant des heures à ° C Au moins des événements lymphocytaires CD ont été détectés

Dégranulation et dosages cytotoxiques directs

Des cellules T non infectées ou CD infectées avec le WT ou des virus NL mutés ont été remises en suspension à un rapport: en présence de cellules mononucléées de sang périphérique autologues activées par IL-interleukine, et d’anticorps monoclonaux anti-CDa Ab HA; Becton Dickinson, tel que décrit Au moins les événements CD-CD NK ont été analysés L’activité NK cytolytique a été évaluée sur des triplicats dans un test standard de libération de Cr, comme décrit

RÉSULTATS

Effet des mutations du motif S sur l’infection des cellules CD T

Pour examiner le rôle du motif S dans le cycle de vie du virus, des substitutions ponctuelles ont été introduites individuellement aux résidus entre les positions S et S dans le motif S de la souche NL VIH. La figure A montre que les effets de ces substitutions vont de l’abolition quasi-totale de la production de virus pour WA et SA est nulle pour les virus exprimant le virus WT Cette constatation a été confirmée par la modulation de leur incapacité à former des syncytia Figure B

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Infectivité des virus HIV-NL de type virus de l’immunodéficience humaine contenant des substitutions d’alanine dans le motif S L’antigène A, p a été quantifié le jour suivant les cellules MT-infection provenant de WT de type sauvage; Les résultats, exprimés en pourcentage par rapport au WT, représentent la moyenne ± déviation standard SD par rapport aux préparations de plasmide-clone indépendantes, en fonction du mutant B, la formation de Syncytium a été quantifiée quelques jours après l’infection par des microscopie à contraste de phase Les résultats, exprimés en unités par rapport au WT, représentent la moyenne ± SD des préparations de clones plasmidiques séparées, en fonction du C mutant, étude cinétique de la production d’antigène p dans le surnageant cellulaire des cellules T CD infectées par WT ou Cette expérience est représentative d’expériences indépendantes avec des préparations séparées de plasmide-clone D, Infectivité des cellules PC HeLa par barre ouverte WT ou mutée noire. barres NL virus Les cellules ont été infectées en triple pendant des heures, et l’activité β-galactosidase a été déterminée dans les extraits cellulaires. Les résultats, exprimés en unités par rapport au WT, sont Présenter la moyenne ± écart-type des préparations de plasmide-clone indépendantes E, Quantification de la protéine gp du VIH associée aux particules dans le WT ou des virus mutés par dosage immuno-enzymatique Les résultats sont présentés comme le rapport gp / p pour chaque échantillon de virus. représentatif des expériences indépendantes Les virus mutés NL sont appelés SA, WA, SA, NA, KA et SA

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Infectivité des virus HIV-NL de type virus de l’immunodéficience humaine contenant des substitutions d’alanine dans le motif S L’antigène A, p a été quantifié le jour suivant les cellules MT-infection provenant de WT de type sauvage; Les résultats, exprimés en pourcentage par rapport au WT, représentent la moyenne ± déviation standard SD par rapport aux préparations de plasmide-clone indépendantes, en fonction du mutant B, la formation de Syncytium a été quantifiée quelques jours après l’infection par des microscopie à contraste de phase Les résultats, exprimés en unités par rapport au WT, représentent la moyenne ± SD des préparations de clones plasmidiques séparées, en fonction du C mutant, étude cinétique de la production d’antigène p dans le surnageant cellulaire des cellules T CD infectées par WT ou Cette expérience est représentative d’expériences indépendantes avec des préparations séparées de plasmide-clone D, Infectivité des cellules PC HeLa par barre ouverte WT ou mutée noire. barres NL virus Les cellules ont été infectées en triple pendant des heures, et l’activité β-galactosidase a été déterminée dans les extraits cellulaires. Les résultats, exprimés en unités par rapport au WT, sont Présenter la moyenne ± écart-type des préparations de plasmide-clone indépendantes E, Quantification de la protéine gp du VIH associée aux particules dans le WT ou des virus mutés par dosage immuno-enzymatique Les résultats sont présentés comme le rapport gp / p pour chaque échantillon de virus. représentatif des expériences indépendantes Les virus mutés NL sont appelés SA, WA, SA, NA, KA et SA

Les études cinétiques de l’infection montrent que la réplication était indétectable avec les virus mutés WA et S, à chaque période par rapport au virus WT dans les cellules CD T purifiées et les cellules Jurkat non montrées Ces données sont cohérentes avec le niveau d’infectiosité détecté dans HeLa Cellules PC Figure D Il est à noter que la quantité de gp incorporée dans les particules virales reste similaire dans toutes les particules de WT et mutantes récoltées. Figure E

Les mutations ponctuelles dans le motif S abolissent l’expression de NKpL

Nous et d’autres chercheurs ont déjà montré que l’infection VIH induit l’expression de certains ligands spécifiques des récepteurs NK, y compris NKpL La figure A montre un pourcentage élevé de cellules T NKpLCD après infection par le virus WT, mais pas d’expression avec les mutants WA et SA Figure A Des résultats similaires ont été obtenus avec des données virales inactivées par la chaleur non représentées ou après stimulation avec les peptides S synthétiques correspondants. Figure B Ces découvertes indiquent que la translocation de surface cellulaire NKpL peut être modulée par des mutations ponctuelles spécifiques dans le motif S

Vue de la figure largeDownload slideExpression de NKpL sur cellules T CD et CDA dégranulation NK-cellulaire médiée par des motifs S mutés A, les cellules T purifiées CD étaient des lignes pointillées non infectées ou des lignes noires infectées pendant la nuit avec WT sauvage ou virus mutés Les cellules ont été colorées avec des ligands NCR Histogrammes ont été déclenchés sur les cellules T CD La superposition montre l’expression des ligands NCR sur les cellules infectées par le VIH par rapport aux cellules non infectées Les nombres correspondent à la proportion de CD T des cellules exprimant des ligands NCR B, l’expression de NKpL sur des lymphocytes T CD purifiés qui ont été traités par UT ou traités avec des peptides S WT ou mutés. Les cellules ont été soit colorées avec des AcM monoclonaux anti-NKpL; Les nombres correspondent à la proportion de cellules T CD exprimant NKpL C et D, l’activité de dégranulation a été évaluée sur des cellules NK activées par l’interleukine contre des cellules T CD autologues, à un rapport E / T de /, dans la présence d’Acm anti-CDa C, les lymphocytes T CD purifiés n’ont pas été infectés NI ou infectés pendant la nuit avec WT ou les virus mutés NL Les placettes pointillées sont bloquées sur les cellules CD-CD NK Le nombre dans chaque panneau correspond à la proportion de cellules NK ou n’expriment pas NKp et CDa D, les cellules T CD étaient non traitées UT ou traitées avec WT ou peptides mutés S Histogrammes ont été bloqués sur les cellules CD-CD NK exprimant NKp Les cellules ont été soit colorées avec des Acm CDA lignes noires ou immunoglobuline G contrôle d’isotope pointillé lignes Les nombres correspondent à la proportion de cellules NK exprimant des virus CDa mutés NL ou des peptides sont désignés par SA, WA, SA, NA, KA et SA. Abréviations: Ig, immunoglobuline; NI, non infecté; UT, non traité; WT, sauvage-typeFigure View largeDownload slideExpression de NKpL sur les lymphocytes T CD et la dégranulation des cellules NK CDa médiée par des motifs S mutés A, lymphocytes T CD purifiés étaient des lignes pointillées non infectées ou des lignes noires infectées pendant la nuit avec WT de type sauvage ou des virus mutés. colorées avec des ligands NCR NKp-immunoglobuline [Ig], NKp-Ig, ou NKp-Ig protéines de fusion Histogrammes ont été bloqués sur les cellules T CD La superposition montre l’expression des ligands NCR sur les cellules infectées par le VIH par rapport aux cellules non infectées proportion de cellules T CD exprimant les ligands NCR B, expression de NKpL sur des cellules T CD purifiées qui étaient non traitées UT ou traitées avec des peptides S WT ou mutés Les cellules ont été soit colorées avec des anticorps monoclonaux anti-NKpL mAbs; Les nombres correspondent à la proportion de cellules T CD exprimant NKpL C et D, l’activité de dégranulation a été évaluée sur des cellules NK activées par l’interleukine contre des cellules T CD autologues, à un rapport E / T de /, dans la présence d’Acm anti-CDa C, les lymphocytes T CD purifiés n’ont pas été infectés NI ou infectés pendant la nuit avec WT ou les virus mutés NL Les placettes pointillées sont bloquées sur les cellules CD-CD NK Le nombre dans chaque panneau correspond à la proportion de cellules NK ou n’expriment pas NKp et CDa D, les cellules T CD étaient non traitées UT ou traitées avec WT ou peptides mutés S Histogrammes ont été bloqués sur les cellules CD-CD NK exprimant NKp Les cellules ont été soit colorées avec des Acm CDA lignes noires ou immunoglobuline G contrôle d’isotope pointillé lignes Les nombres correspondent à la proportion de cellules NK exprimant des virus CDa mutés NL ou des peptides sont désignés par SA, WA, SA, NA, KA et SA. Abréviations: Ig, immunoglobuline; NI, non infecté; UT, non traité; WT, type sauvage

La dégranulation des cellules NK a été modulée en présence de cellules T CD autologues infectées par des mutants viraux S

Comme l’expression de NKpL est modulée sur des lymphocytes T CD après infection par certains mutants viraux S, nous avons ensuite étudié leur sensibilité à la dégranulation NK. La figure C montre que les cellules NKp NK expriment des taux élevés de CDa en présence du virus WT et du SA et Par comparaison, en présence de cellules T CD infectées avec les autres mutants viraux, celles qui n’ont pas induit l’expression de NKpL sur les cellules T CD, le niveau de dégranulation NK reste similaire à celui observé en présence de Au total, ces résultats suggèrent que des substitutions spécifiques dans le motif S ont des conséquences majeures pour la modulation de la sensibilité des cellules NK des cellules non infectées Figure C Les résultats étaient similaires en présence de particules virales inactivées thermiquement. Cellules cibles CD

Elicitation d’anticorps largement neutralisants de type S chez la souris

Nous avons donc immunisé des souris avec WT et chacun des peptides S mutés pour générer des anticorps spécifiques. Tous ont montré des réponses immunitaires robustes contre leurs séquences S spécifiques sur des données ELISA non présentées. Constamment avec nos découvertes précédentes , expression NKpL Figure A et dégranulation des cellules NK La Figure B était fortement inhibée en présence d’Ig provenant à la fois de souris S-WT et de souris mutantes-peptides, indépendamment de la position des substitutions. Des résultats similaires ont été observés avec une analyse standard de notre test de chrome, suggérant que toutes les immunoglobulines souris immunisées par des peptides protègent les cellules T CD contre la lyse autologue par les cellules NKp NK

Figure

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Inhibition de NKpL sur les lymphocytes T CD, dégranulation des cellules NK et neutralisation de l’infection virale par l’immunoglobuline Ig murine générée à partir des peptides S mutés. L’expression de NKpL sur des lymphocytes T CD purifiés a été déterminée quelques heures après la stimulation S en présence d’Ig de peptides S de type sauvage ou mutés S Les nombres correspondent à la proportion de lymphocytes T CD exprimant NKpL B, Degranulation de cellules NK autologues en présence d’Ig de WT ou de peptides S mutés Proliférations de cellules T CD pendant des minutes avec des Ig purifiées de souris immunisées avec adjuvant seul Ig-Adj, WT ou des peptides mutés, puis incubés avec des cellules NK autologues à un rapport E / T de / Les parcelles pointillées sont bloquées sur des cellules CD-CD NK Le nombre dans chaque panneau correspond à la proportion de cellules NK Exprimait ou n’exprimait pas NKp et CDa C et D, test p sur des lymphocytes T CD purifiés infectés par des virus compétents du panel gauche NL ou NDK du panel droit préincubés pendant des minutes avec des Ig purifiées provenant de souris immunisées avec des adjuvants alon. e Ig-Adj, WT ou peptides mutés incluant SA ▪, WA, SA, NA ○, KA •, et SA □ C, effet dépendant de la concentration Des virus compétents ont été incubés avec – μg / mL d’Ig purifiée Au lendemain de l’infection L’antigène p a été quantifié dans le surnageant cellulaire D, effet dépendant du temps Des virus compétents ont été incubés avec μg / mL d’Ig. La concentration en p dans le surnageant cellulaire a été testée tous les jours pendant plusieurs jours après l’infection. représentatif des expériences indépendantes Les peptides mutés sont désignés par SA, WA, SA, NA, KA et SA Abréviations: Ig-Adj, immunoglobuline de souris immunisées avec l’adjuvant seul; NT, immunoglobulines provenant de souris non immunisées; WT, type sauvage

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Inhibition de NKpL sur les lymphocytes T CD, dégranulation des cellules NK et neutralisation de l’infection virale par l’immunoglobuline Ig murine générée à partir des peptides S mutés. L’expression de NKpL sur des lymphocytes T CD purifiés a été déterminée quelques heures après la stimulation S en présence d’Ig de peptides S de type sauvage ou mutés S Les nombres correspondent à la proportion de lymphocytes T CD exprimant NKpL B, Degranulation de cellules NK autologues en présence d’Ig de WT ou de peptides S mutés Proliférations de cellules T CD pendant des minutes avec des Ig purifiées de souris immunisées avec adjuvant seul Ig-Adj, WT ou des peptides mutés, puis incubés avec des cellules NK autologues à un rapport E / T de / Les parcelles pointillées sont bloquées sur des cellules CD-CD NK Le nombre dans chaque panneau correspond à la proportion de cellules NK Exprimait ou n’exprimait pas NKp et CDa C et D, test p sur des lymphocytes T CD purifiés infectés par des virus compétents du panel gauche NL ou NDK du panel droit préincubés pendant des minutes avec des Ig purifiées provenant de souris immunisées avec des adjuvants alon. e Ig-Adj, WT ou peptides mutés incluant SA ▪, WA, SA, NA ○, KA •, et SA □ C, effet dépendant de la concentration Des virus compétents ont été incubés avec – μg / mL d’Ig purifiée Au lendemain de l’infection L’antigène p a été quantifié dans le surnageant cellulaire D, effet dépendant du temps Des virus compétents ont été incubés avec μg / mL d’Ig. La concentration en p dans le surnageant cellulaire a été testée tous les jours pendant plusieurs jours après l’infection. représentatif des expériences indépendantes Les peptides mutés sont désignés par SA, WA, SA, NA, KA et SA Abréviations: Ig-Adj, immunoglobuline de souris immunisées avec l’adjuvant seul; NT, immunoglobulines provenant de souris non immunisées; WT, type sauvage

En outre, nous avons déterminé la capacité de neutralisation virale des immunoglobulines à partir de S-WT et de mutants sur des souches VIH-clade croisées en utilisant différents tests de neutralisation à base de cellules. Une activité robuste et largement neutralisante n’a été détectée qu’avec des immunoglobulines de souris mutantes Plus important encore, les immunoglobulines des souris immunisées par le mutant-peptide WA ont été capables de neutraliser fortement toutes les souches de VIH de niveau et de niveau des différents clades A, C et E, dans le tableau HeLa-PC ou dans la table TZM-bl Comme prévu , aucune activité neutralisante n’a été détectée avec l’immunoglobuline des souris immunisées par le peptide WT, et en présence de la souche VIH VSV et ROD VIH du stomatose vésiculaire, démontrer la spécificité de la Table de réponse

Tableau Effet Des Substitutions D’un Seul Acide Aminé Dans Le Peptide S Sur La Sensibilité Neutralisante Des Immunoglobulines Murines Dans Le Corécepteur Clade De Niveau De Strain De Test Hela PC

Spécificité S / gp

Mutant IC μg / ml BRU B X WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA NDK B X WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA NL B X WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA JR-CSF B R WT SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA YU- B R WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA Strain Tier Clade Corécepteur

Spécificité S / gp

Mutant IC μg / ml BRU B X WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA NDK B X WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA NL B X WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA JR-CSF B R WT SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA YU- B R WT & gt; SA & gt; WA SA NA KA & gt; SA Abréviations: IC, concentration inhibitrice maximale de moitié; WT, immunoglobulines provenant de souris immunisées avec le peptide S de type sauvage; SA, WA, SA, NA, KA et SA, immunoglobulines de souris immunisées avec des peptides S mutés

Tableau Sensibilité à la neutralisation croisée des immunoglobulines murines induites par le peptide S-mutant dans le test TZM-bl Strain Coréptor Clade Tier

Spécificité S / gp IC mutant μg / mL VI A R NT & gt; WT & gt; SA & gt; WA BRU B X WT & gt; SA & gt; WA NDK B X WT & gt; SA & gt; WA NL B X WT & gt; SA & gt; WA JR-CSF B R WT & gt; SA & gt; WA YU- B R WT & gt; SA & gt; WA TV C R NT & gt; WT & gt; SA & gt; WA CM E R NT & gt; WT & gt; SA WA ROD VIH-WT & gt; SA & gt; WA & gt; VSV NT & gt; WT & gt; SA & gt; WA & gt; Strain Tier Clade Corécepteur

Spécificité S / gp IC mutant μg / mL VI A R NT & gt; WT & gt; SA & gt; WA BRU B X WT & gt; SA & gt; WA NDK B X WT & gt; SA & gt; WA NL B X WT & gt; SA & gt; WA JR-CSF B R WT & gt; SA & gt; WA YU- B R WT & gt; SA & gt; WA TV C R NT & gt; WT & gt; SA & gt; WA CM E R NT & gt; WT & gt; SA WA ROD VIH-WT & gt; SA & gt; WA & gt; VSV NT & gt; WT & gt; SA & gt; WA & gt; Abréviations: IC, concentration inhibitrice demi-maximale; NT, immunoglobulines provenant de souris non immunisées; VSV, virus de la stomatite vésiculaire, en tant que témoin négatif; WT, immunoglobulines de souris immunisées avec le peptide WT S; SA et WA, immunoglobulines de souris immunisées avec des peptides S mutés SA ou WA. Pour confirmer ces données, nous avons cherché à détecter la production de p par des cellules T CD purifiées infectées par des souches VIH ou NLK. La figure C montre que la production de p reste indétectable. immunoglobulines de souris immunisées par mutant WA-peptide, pour une concentration supérieure à μg / mL d’immunoglobulines à tout moment après l’infection En revanche, les immunoglobulines des souris immunisées par les mutants SA, NA et SA semblent retarder seulement la production de p. soutenir la conclusion que la substitution à la position W dans le motif S a provoqué une capacité à neutraliser les virus en croix, dont l’ampleur, la largeur et la durabilité sont remarquables

Abs contre le mutant WA S élué du plasma du VIH – Les patients ont montré une activité neutralisante

Nous avons ensuite cherché à déterminer l’efficacité des ABS WA-S purifiés à partir d’échantillons plasmatiques de patients infectés par le VIH. Des anticorps anti-S-WT ont été trouvés dans environ% / des échantillons de plasma de patients infectés par le VIH, avec des valeurs allant de AU / mL à AU / mL, avec un très significatif avec le nombre de CD P & lt; ; Spearman test, comme décrit Cependant, Abs spécifiquement dirigé contre le motif S-mutée WA ont été détectés uniquement dans les échantillons de plasma des patients. Tableau Ces anticorps spécifiques étaient des données d’isotypes de l’immunoglobuline G non montrés et ont été détectés exclusivement chez les patients comptes et charges virales indétectables & lt; copies / mL Tableau; de noter, ces ABS ne sont pas détectables dans le plasma de donneurs sains données non montrées

Caractéristiques de la table et activité neutralisante des patients infectés par le VIH produisant des anticorps anti-WA Réactifs infectés par le VIH #a # # # # # Nombre de CD / mm Rapport CD / CD Nombre de copies de charge virale / mL & lt; & lt; & lt; & lt; & lt; & lt; Anti-WA Ab

Activité NAb de l’UA / mL dans le plasmab IC en μg / mL NL niveau

– Clade B & lt; & gt; YU- tier – clade

B & lt; Activité NAb avec Abc IC purifié en clade NDK μg / mL

B & gt; & lt; NL niveau

– Clade B & gt; & lt; Niveau JR-CSF

– Clade B & gt; & gt; & gt; YU- niveau

– Clade B & gt; ROD VIH- & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; Activité NAb avec Abd IC purifié en μg / mL VI tier

– Clade A & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; Niveau BRU

– Clade B & gt; NL niveau

– Clade B & gt; & lt; Niveau JRCSF

– Clade B & gt; & gt; & gt; YU- niveau

– Clade B & gt; & gt; & gt; MW

tier – clade C & gt; & lt; & lt; & lt; & lt; Niveau TV

– Clade C & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & lt; Niveau CM

– Clade E & gt; & gt; & gt; & gt; ROD VIH- & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; VSV & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; Patients infectés par le VIH #a # # # # # Nombre de CD / mm Rapport CD / CD Nombre de copies de charge virale / ml & lt; & lt; & lt; & lt; & lt; & lt; Anti-WA Ab

Activité NAb de l’UA / mL dans le plasmab IC en μg / mL NL niveau

– Clade B & lt; & gt; YU- tier – clade

B & lt; Activité NAb avec Abc IC purifié en clade NDK μg / mL

B & gt; & lt; NL niveau

– Clade B & gt; & lt; Niveau JR-CSF

– Clade B & gt; & gt; & gt; YU- niveau

– Clade B & gt; ROD VIH- & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; Activité NAb avec Abd IC purifié en μg / mL VI tier

– Clade A & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; Niveau BRU

– Clade B & gt; NL niveau

– Clade B & gt; & lt; Niveau JRCSF

– Clade B & gt; & gt; & gt; YU- niveau

– Clade B & gt; & gt; & gt; MW

tier – clade C & gt; & lt; & lt; & lt; & lt; Niveau TV

– Clade C & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & lt; Niveau CM

– Clade E & gt; & gt; & gt; & gt; ROD VIH- & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; VSV & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; & gt; Abréviations: Ab, anticorps; IC, concentration inhibitrice maximale de moitié; NAb, anticorps neutralisant; VSV, virus de la stomatite vésiculeuse, en tant que contrôle négatif #: contrôle négatif d’un échantillon infecté par le virus de l’immunodéficience humaine produisant des anticorps anti-S WT AU / mL, mais non détectables Les immunoglobulines Abs réactives au WA ont été immunopurifiées avec l’activité sérum déterminé dans Hela PC assayc Activité NAb des immunoglobulines anti-WA purifiées dans des cellules Hela PC Activité des NAb dans des immunoglobulines anti-WA purifiées dans des cellules TZM-bl ViewView Une activité neutralisante a été mesurée avec tous ces sérums après leur purification immunitaire contre le WA En outre, une étude cinétique a montré que la production de p dans le surnageant acellulaire était plus faible en présence d’ABS purifiés provenant de patients infectés par le VIH indépendamment du temps écoulé depuis l’infection que chez les témoins Figure B Il est important de noter qu’une expérience de réactivité croisée a révélé que le NAb purifié par WA réagissait seulement avec son peptide S mutant correspondant. de, mais pas avec le peptide WT S ou d’autres peptides testés Figure supplémentaire

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Neutralisation du virus, inhibition de NKpL sur les cellules T CD et dégranulation des cellules NK par l’Ac anti-WA purifié immunoprécipité des patients infectés par le VIH A et B, p sur des cellules T CD purifiées infectées par des virus compétents du panel gauche NLK ou NDK préincubés pendant quelques minutes. sans anticorps monoclonaux mAb ou avec des anticorps monoclonaux anti-S de type sauvage mAb; Anticorps immunopurifiés anti-S, ○, anti-S-WT provenant d’un patient infecté par le VIH #, □ ou d’un anticorps immunopurifié anti-S-WA provenant de patients infectés par le VIH: # •, # ▪, # ▴, # ▾, et # Les résultats sont exprimés en moyenne de trois exemplaires et sont représentatifs des expériences indépendantes A, effet dépendant de la concentration Des virus compétents ont été incubés avec – μg / mL d’Ig d’immunoglobuline purifiée Au jour après l’infection, l’antigène p a été quantifié dans le surnageant cellulaire B, Effet dépendant du temps Des virus compétents ont été incubés avec μg / mL d’Ig. La concentration en p dans le surnageant cellulaire a été testée tous les jours pendant plusieurs jours après infection. Les résultats sont exprimés en moyenne triple et sont représentatifs des expériences indépendantes C, expression NKpL sur CD purifié. Les cellules T ont été déterminées des heures après l’infection. Les nombres correspondent à la proportion de lymphocytes T CD exprimant NKpL D, la dégranulation des cellules NK. Les lymphocytes T CD préincubés pendant des minutes sans NT, ou des immunoglobulines WA-Ig provenant d’échantillons humains. ,,,,,, ou anti-S mAbs, puis incubés avec des cellules NK autologues à un ratio E / T de / Les parcelles pointillées sont bloquées sur des cellules CD-CD NK Le nombre dans chaque panneau correspond à la proportion de cellules NK qui a exprimé ou non les abréviations NKp et CDa: Ig, immunoglobuline; NT, immunoglobulines de souris non immunisées

Figure

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Neutralisation du virus, inhibition de NKpL sur les cellules T CD et dégranulation des cellules NK par l’Ac anti-WA purifié immunoprécipité des patients infectés par le VIH A et B, p sur des cellules T CD purifiées infectées par des virus compétents du panel gauche NLK ou NDK préincubés pendant quelques minutes. sans anticorps monoclonaux mAb ou avec des anticorps monoclonaux anti-S de type sauvage mAb; Anticorps immunopurifiés anti-S, ○, anti-S-WT provenant d’un patient infecté par le VIH #, □ ou d’un anticorps immunopurifié anti-S-WA provenant de patients infectés par le VIH: # •, # ▪, # ▴, # ▾, et # Les résultats sont exprimés en moyenne de trois exemplaires et sont représentatifs des expériences indépendantes A, effet dépendant de la concentration Des virus compétents ont été incubés avec – μg / mL d’Ig d’immunoglobuline purifiée Au jour après l’infection, l’antigène p a été quantifié dans le surnageant cellulaire B, Effet dépendant du temps Des virus compétents ont été incubés avec μg / mL d’Ig. La concentration en p dans le surnageant cellulaire a été testée tous les jours pendant plusieurs jours après infection. Les résultats sont exprimés en moyenne triple et sont représentatifs des expériences indépendantes C, expression NKpL sur CD purifié. Les cellules T ont été déterminées des heures après l’infection. Les nombres correspondent à la proportion de lymphocytes T CD exprimant NKpL D, la dégranulation des cellules NK. Les lymphocytes T CD préincubés pendant des minutes sans NT, ou des immunoglobulines WA-Ig provenant d’échantillons humains. ,,,,,, ou anti-S mAbs, puis incubés avec des cellules NK autologues à un ratio E / T de / Les parcelles pointillées sont bloquées sur des cellules CD-CD NK Le nombre dans chaque panneau correspond à la proportion de cellules NK qui a exprimé ou non les abréviations NKp et CDa: Ig, immunoglobuline; NT, immunoglobulines de souris non immunisées

Abs-purifié WA de la plupart des patients ont été capables de neutraliser à des titres élevés tous ou la plupart des clades B et C et des niveaux de virus du tableau B. De façon frappante, les ABS purifiés de ces patients étaient également réactifs contre le clade de classe C PSV-TV et clade E Virus PSV-CM Absence de anticorps anti-WA neutralisé par HIV-ROD ou VSV, utilisé comme témoin négatifNous avons ensuite examiné les effets de ces NAbs anti-WA sur l’expression NKpL et la dégranulation NK, lorsque des cellules T CD autologues étaient co- Nous avons observé que ces NAbs ont conservé ces activités NKpL expression et dégranulation NK, à des niveaux similaires à ceux observés en présence du contrôle S WT Ab Figure C et D Des résultats similaires ont été observés avec une norme. test de lyse Figure supplémentaire Ceci suggère que les anticorps humains réactifs à la WA protègent les cellules T CD contre la lyse autologue par des cellules NKp NK activées

DISCUSSION

Dans cette étude, le balayage d’alanine nous a permis d’identifier une position spécifique dans le motif S qui inhibe l’entrée du VIH, déclenche des anticorps neutralisants et reste capable de contrer la cytotoxicité NK contre les cellules T CD. Des études précédentes ont partiellement caractérisé les effets Bien que certaines de ces mutations altèrent les fonctions de l’enveloppe, les différences entre ces résultats peuvent être attribuées aux différents tests utilisés pour tester ces fonctions, par exemple, les essais de fusion cellule-cellule vs les enquêtes d’entrée de virus en association avec des modifications conformationnelles Néanmoins, dans cette étude, des substitutions spécifiques dans le motif S – WA, SA, NA et SA – étaient clairement associées à une infectivité altérée et à une entrée virale. Ceci est cohérent avec l’absence d’induction NKpL sur CD T cellules en présence de ces mutants et avec leur reconnaissance par des cellules NK activées autologues. A noter, l’expression de NKpL a été détectée après infection par Pseudovirus déficient pour la fusion Env, mais pas pour la communication personnelle DR liaison CD, J Blanco, IrsiCaixa-VIH / ACAT, Barcelone, Espagne, indiquant que la fixation du motif S sur les cellules se produit après l’interaction CD, mais avant la fusion Cependant, des études cinétiques dans des cellules T CD ont montré que pour la plupart de ces mutants, la protection était transitoire et rapidement revenue au niveau observé avec les cellules T CD. le WT Cependant, l’effet neutralisant de l’ABS anti-muté reste complètement préservé pendant le suivi. Ceci a été renforcé par des données provenant de divers dosages neutralisants et suggère que comparé aux autres substitutions et autres NAbs connus ie, F, anti-WA Abs sont sans pareil dans leur ampleur, la largeur et la capacité de conférer durablement leurs effets spécifiques sur les virus cross-clade Bien que certains plus tôt Des rapports ont montré que les changements de gp peuvent altérer partiellement la sensibilité de neutralisation , ceci est la première étude montrant qu’une substitution ponctuelle spécifique dans un motif très fortement conservé de gp induit la production de NAb lorsque le motif WT lui-même la quasi-absence d’activité neutralisante contre cette région gp Ceci est confirmé par la présence in vivo de NAbs anti-WA naturels dans les sérums de patients infectés par le VIH. Ceci suggère que les épitopes conservés dans cette région unique pourraient être immunogènes après substitutions spécifiques, même si la mutation WA confère une infectiosité relativement inefficace in vitroL’identification par mutation d’au moins une position majeure dans un motif gp fortement conservé suggère fortement que le motif S joue un rôle important dans la génération d’un titre élevé de réponses largement NAb. se pose naturellement la question de savoir pourquoi une région de gp qui est si fortement protégée et difficile à cibler par les NAbs est un déterminant clé du pote Les réponses de NAb chez les individus infectés par le VIH Le mécanisme précis par lequel une substitution d’alanine spécifique dans le motif S permet l’exposition des épitopes de neutralisation reste flou; l’absence de cette région de la structure cristalline de l’ectodomaine gp empêche malheureusement une compréhension complète des changements structurels qui contribuent à l’exposition des motifs clés après des substitutions spécifiques Cependant, l’absence de réactivité croisée de l’anti-WA-muté Abs avec le peptide S WT, ainsi que l’étude de modélisation structurelle en cours, a suggéré que la stabilité du peptide muté WA avec le gCqR est affectée, par rapport à la communication personnelle du peptide S WT, M Baaden, Institut Curie, Paris, France Cependant, nos données montrent également que l’acquisition de capacités de neutralisation préserve la capacité unique des anticorps anti-S à inhiber l’expression de NKpL sur les cellules T CD, comme décrit précédemment pour les anti-WT-S. Abs, et confirmé in vivo dans un modèle de macaque infecté par le virus de l’immunodéficience simienne Ce phénomène est essentiel en raison de l’importance critique de la conservation des cellules T CD n dans cette maladie, des résultats cliniques défavorables étant corrélés avec l’échec de la récupération CD chez les non-répondeurs immunologiques Nos données montrent que la mutation d’un résidu spécifique dans le motif S génère des ABS qui combinent une capacité à neutraliser le virus avec une protection contre Ces résultats fournissent une base pour la conception rationnelle d’un vaccin à double usage pour stimuler à la fois la neutralisation cross-clade du virus et de protéger de l’épuisement des cellules T CD

Remarques

Remerciements Nous tenons à remercier M Baaden et M Puizzi Institut de biologie physique et chimique, Institut Curie, Paris, France pour l’étude structurelle en cours; O Schwartz et Institut A Moris Pasteur, Paris, France pour les cellules PC HeLa; et C Berlioz-Torrent Cochin Institute, Paris, France pour les cellules rapporteur Tzm-bl VIH-gp F mAb a été obtenu grâce au programme de recherche et de référence sur le SIDA, Division du SIDA, Plasmides et cellules de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Les tests Tzm-bl ont été obtenus auprès du Centre for AIDS Reagents, de l’Institut national de contrôle et de normes biologiques, Health Protection Agency. Nous remercions également les patients infectés par le VIH de cette étude. Soutien financier Ce travail a été soutenu en partie par l’Institut National de Recherche Médicale , l’Université Pierre et Marie Curie, Paris, et l’Agence Nationale de la Recherche THERVAX, le numéro de subvention PCP a été soutenu par une bourse de l’Agence Nationale de la Recherche et de la Technologie ANRT, et AS a été soutenu par une bourse CIFRE du ANRT et InnaVirVax number / VV est chercheur au Centre National de la Recherche Scientifique Conflits d’intérêts potentiels JC est Chief Executive Office r d’InnaVirVax; R H T F est un employé d’InnaVirVax; et VV et PD sont des inventeurs sur une demande de brevet décrivant la composition pour prévenir et / ou traiter une infection par le VIH-virus EP Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts considérer pertinent au contenu du manuscrit ont été divulgués