Médecine interne Techniques de diagnostic de laboratoire pour les patients atteints de la maladie de Lyme précoce associée à l’érythème migrant: une comparaison des différentes techniques

Techniques de diagnostic de laboratoire pour les patients atteints de la maladie de Lyme précoce associée à l’érythème migrant: une comparaison des différentes techniques

Récemment, un certain nombre d’améliorations ont été apportées aux modalités diagnostiques pour la détection de l’infection à Borrelia burgdorferi. Ces études comprennent des hémocultures à grand volume, des réactions PCR en chaîne par polymérase quantitative et des tests sérologiques en stades. Qui avait un diagnostic clinique d’érythème migrant La PCR quantitative sur matériel dérivé de biopsie cutanée était la méthode diagnostique la plus sensible%, suivi par le test sérologique en cours des échantillons en phase de convalescence%, PCR classique nichée%, culture cutanée%, hémoculture%, Les résultats de tous les essais ont été négatifs pour les patients% Nous concluons que le diagnostic clinique de l’érythème migrant est très précis dans une région où B burgdorferi est endémique si elle est faite par un personnel de santé expérimenté, mais certains les patients avec ce diagnostic peuvent ne pas avoir l’infection de B burgdorferi Aucune modalité diagnostique simple ne convient tion de B burgdorferi chez tous les patients atteints d’érythème migrant

La maladie de Lyme, causée par Borrelia burgdorferi, est la maladie vectorielle la plus répandue aux États-Unis, avec ç, cas signalés annuellement Erythema migrans est la caractéristique clinique la plus caractéristique et la plus commune de la maladie. Depuis notre dernier rapport de comparaison de tests diagnostiques chez des patients ayant eu un érythème migrant diagnostiqué chez , un certain nombre d’améliorations ont été apportées aux tests diagnostiques en laboratoire pour cette infection, y compris des hémocultures à grand volume pour cultiver B burgdorferi ; tests sérologiques à l’échelle, avec interprétation des immunoblots en utilisant des critères de consensus ; L’objectif de la présente étude était de comparer la sensibilité de divers tests de laboratoire utilisés dans notre centre pendant l’été pour le diagnostic de l’infection à B burgdorferi chez les adultes atteints d’érythème migrant.

Matériaux et méthodes

le broyeur de microtissue Spectrum Medical Industries, qui contenait des mL de milieu BSK incomplet, et qui ont été broyés; – mL de cette suspension a été ajouté à un tube bouchon -mL contenant ml de milieu BSK complet avec sérum de lapin et solution de% BSA, mais sans antibiotiques. Le tube à bouchon à vis a été fermé hermétiquement et incubé à ̊C pendant la durée de période de culture La suspension restante plus le fragment de peau lui-même ont été retournés au milieu de transport et envoyés pour des études PCR. Les cultures ont été examinées par microscopie à fluorescence pendant des semaines et, par la suite, jusqu’à des semaines. Six échantillons de plasma ml au total ont été recueillis dans des tubes de prélèvement de sang EDTA provenant de chaque patient par une seule ponction veineuse. Le plasma a été séparé après centrifugation du sang à g pendant min. ont été chacun inoculés dans un flacon en plastique à bouchon à vis de -mL qui contenait des mL de milieu BSK sans antibiotique, qui a été préparé comme décrit ailleurs Les cultures ont été incubées à ̊C pendant des semaines et L’ADN purifié a été extrait des échantillons de biopsie et du milieu de transport associé par l’utilisation du kit d’isolement d’acide nucléique IsoQuick Orca Research, comme décrit ailleurs L’ADN purifié a été remis en suspension dans μL de la région waterA -bp de le gène flagellin flaB de B burgdorferi a été amplifié par l’utilisation d’un protocole PCR niché ailleurs par Barbour et al . Les amplifications PCR de premier et second tour ont été réalisées dans un volume total de μL contenant mM chaque désoxynucléoside triphosphates, U de Taq ADN polymérase Roche Molecular Biochemicals, et pmol de chaque amorce dans un thermocycleur “moteur à ADN” MJ Research Le gabarit pour la réaction de premier tour était μL d’ADN spécimen remis en suspension, et μL de la réaction de premier tour a été utilisé comme matrice pour le deuxième cycle de PCR Le profil de cycle thermique pour les deux cycles de PCR consistait en un cycle de -min à ̊C, suivi de cycles de dénaturation à ̊C pendant s, recuit à ̊C fo Pour éviter la contamination croisée et le transfert d’échantillons, le traitement des échantillons avant et après la PCR et l’amplification par PCR ont été effectués dans des pièces séparées et des pointes de pipette bouchées ont été utilisées pour tous les transferts de fluides. des moyens d’électrophorèse sur gel d’agarose dans un tampon Tris-borate-EDTA Une PCR quantitative a été réalisée par amplification de B burgdorferi recA dans un Lightcycler Roche Molecular Biochemicals, comme décrit ailleurs En bref, la PCR a été réalisée dans un volume final de μL Mélanger Roche, mM MgCl, μM de chaque amorce et μL d’ADN échantillon remis en suspension Les amorces spécifiques recA étaient nTMF et nTMR, comme décrit ailleurs Cet ensemble d’amorces est spécifique à B burgdorferi et a entraîné une sensibilité de détection de copie unique. la variation de la PCR quantitative variait de% & gt; copies par réaction de PCR à% – copies par réaction de PCR, comme déterminé en testant% des échantillons positifs dans au moins différents essais de PCR Le programme d ‘amplification consistait à chauffer à ̊C pendant s, suivi par des cycles de chauffage à ̊C / s à ̊C avec a -s hold, refroidissement à ̊C / s à ̊C avec -s hold, et chauffage à ̊C / s à ̊C avec -s hold Le produit fluorescent a été recueilli à ̊C à la dernière étape de chaque cycle, pour minimiser le signal des produits non spécifiques Une série de dilutions contenant des copies du gène cible a été incluse dans chaque expérience de PCR et utilisée pour générer une courbe standard pour l’estimation des nombres de spirochètes dans les échantillons cliniques. En outre, les échantillons dépourvus d’ADN matrice ont été inclus comme témoins négatifs dans chaque test. Essai de PCR, pour tenir compte de toute contamination au cours de la procédure PCR Un échantillon n’a été considéré comme positif que s’il répondait aux deux critères suivants: il présentait une phase d’amplification log-linéaire exponentielle dans le tube fluorescent Cette analyse a montré un pic spécifique avec un Tm à ̊C dans l’analyse de la courbe de fusion et / ou une bande spécifique avec la taille moléculaire attendue sur un gel d’agarose% par analyse post-PCR Une analyse du nombre de B burgdorferi détectés dans la peau en relation avec d’autres résultats d’essais cliniques et de laboratoire seront fournis dans un document distinct. Essais sérologiques Des échantillons de sérum de phase aiguë et convalescente ont été testés en utilisant un ELISA Wampole Laboratories polyvalent IgM / IgG, effectué conformément aux instructions du fabricant. Les tests d’immunoblot IgM et IgG disponibles dans le commerce, MarDX Diagnostics, selon les instructions du fabricant, ont permis de tester le test ELISA. Pour cette étude, la séropositivité sur l’échantillon de phase aiguë nécessite une immunoblot IgM positive, alors que IgM ou IgG positivité a été considérée comme indicative de la séropositivité sur le spécimen en phase de convalescence. Les immunoblots ont été Conformité avec les critères recommandés

Résultats

La population étudiée comprenait des patients adultes non traités qui ont consenti à fournir un diamètre de spécimen de biopsie cutanée, mm et une phlébotomie pour la culture et des tests sérologiques pendant l’été. Les caractéristiques cliniques des participants sont présentées dans le tableau

Caractéristiques des patients adultes atteints d’érythème migrant.Caractéristiques cliniques des patients adultes atteints d’érythème migrant.Sur les méthodes de diagnostic, la PCR quantitative sur matériel dérivé de biopsie cutanée était la plus sensible pour [%] des sujets, suivie de tests sérologiques des échantillons en phase de convalescence pour [%], PCR nichée conventionnelle sur matériel dérivé de biopsie cutanée pour [%], culture cutanée pour [%], hémoculture pour [%], et test sérologique des échantillons en phase aiguë pour [%] ; La PCR quantitative d’un échantillon cutané était significativement plus sensible que la culture cutanée du même spécimen de biopsie cutanée P =, par le test exact de Fisher, mais elle n’était pas significativement plus sensible que la PCR nichée conventionnelle P =, par Fisher exact test, -tail

Comparaison des tests diagnostiques pour les patients adultes atteints d’érythème migrantTable View largeTélécharge Comparaison des tests diagnostiques pour les patients adultes atteints d’érythème migrantCulture positive de peau ou de sang chez les patients%, incluant les patients ayant un résultat hémoculturique positif et un résultat de culture négatif d’un échantillon de peau Les résultats du test négatif dans tous les essais sont survenus chez% des patients, qui sont tous retournés pour un test sérologique en phase de convalescence

Discussion

Afin de valider l’exactitude du diagnostic clinique, de mieux comprendre la pathogenèse de l’infection et d’évaluer la sensibilité des tests diagnostiques, des cas d’infection à B burgdorferi authentifiés en laboratoire sont importants dans des essais expérimentaux d’agents thérapeutiques et de vaccins. un échantillon de biopsie cutanée de -mm de diamètre était positif dans le tableau du% de patients, un chiffre comparable à notre étude, dans lequel le rendement était de% des sujets. Une sensibilité un peu plus grande a été rapportée par Berger et al. un diamètre d’échantillon de peau plus grand, mm, et par Steere , pour qui le résultat était% parmi les participants à l’essai vaccinal, qui peuvent avoir présenté plus tôt au cours de l’infection Nous avons montré ailleurs que le rendement de culture cutanée était inversement corrélé avec la durée de la lésion érythémateuse migrante Le rendement de la culture cutanée dans différents laboratoires peut également être affecté par le choix des ingrédients spécifiques utilisés e milieu BSK; la préparation particulière de BSA, par exemple, affectera le potentiel favorisant la croissance Le rendement de nos cultures a augmenté à% quand les résultats des hémocultures de grand volume sont inclus Comme rapporté ailleurs, le rétablissement de B burgdorferi du sang dépasse% si de grands volumes ç mL de plasma sont cultivés La PCR quantitative était plus sensible que la culture et dépassait le taux de positivité obtenu par nous pour la PCR non quantitative dans la présente étude%, dans notre étude précédente% , et dans la plupart des études par D’autres chercheurs Dans une évaluation des nombres connus de B burgdorferi cultivés, la PCR quantitative a également été jugée plus sensible que la PCR non quantitative utilisée dans les données d’étude actuelles non montrées. La sensibilité accrue de la PCR quantitative pourrait être due à l’amélioration de l’instrumentation maladie du sommeil. Optique de haute qualité pour la détection du produit de PCR par fluorescence ou des différences dans le choix de la cible d’ADN La spécificité de l’essai est inconnue, parce que nous n’avons pas l’évaluer sur des échantillons cliniques de patients sans maladie de Lyme Jusqu’à ce que la spécificité des techniques PCR quantitatives soit déterminée, l’utilité clinique d’un tel test par rapport aux autres modalités reste incertaine. Cependant, des cas avec un résultat PCR positif mais un PCR nested négatif résultat, la culture était positive, et le cas additionnel qui était culture négative était séropositif. La sensibilité du test sérologique en stade des échantillons de phase aiguë était de%; pour les échantillons de phase aiguë et de phase convalescente, il était de%%, si les patients qui ne sont pas retournés pour un test de suivi sont exclus. Nos résultats sont comparables à ou plutôt meilleurs que ceux trouvés dans d’autres études sur les tests sérologiques des patients atteints d’érythème migrant et montrent que ce test est insensible au diagnostic au moment de la présentation et que tous les patients ne seront pas testés positifs après un traitement antibiotiqueSi l’intérêt, les patients ne sont pas testés positifs par l’un ou l’autre de ces infection à B burgdorferi Il est maintenant bien reconnu qu’une lésion cutanée d’apparence identique peut survenir en l’absence d’infection à B burgdorferi dans le sud des États-Unis. De plus, dans un essai sur vaccin OspA récemment rapporté, les patients du groupe placebo ont développé un érythème. migrans sans preuve de laboratoire d’infection à B burgdorferi Un nombre à peu près égal de cas d’érythème migrant sans documentation de laboratoire les vaccinés, ce qui implique un manque d’efficacité vaccinale pour ce sous-groupe de patients Le vaccin étant très efficace pour prévenir les cas d’érythème migrant pour lesquels il existe des preuves microbiologiques d’infection à B burgdorferi, le manque d’efficacité soulève la suspicion d’une étiologie alternative outre B burgdorferi Il est également concevable que certains patients séropositifs mais négatifs à la culture et à la PCR ne présentent pas d’infection à B. burgdorferi. Hypothétiquement, la réactivité croisée d’anticorps dirigés contre un autre agent borrélial pourrait expliquer une partie de ces cas. En résumé, les progrès de la technologie PCR sont associés à une sensibilité accrue pour la détection de B burgdorferi dans des échantillons de peau obtenus à partir de patients adultes non traités avec érythème migrant. presque aussi sensible que la culture de -mm échantillons de biopsie de peau pour la récupération Les tests sérologiques en deux étapes demeurent une technique diagnostique assez sensible chez les patients qui reçoivent un traitement antibiotique au moment de la présentation, à condition qu’un échantillon de sérum en phase de convalescence convenablement chronométré puisse être obtenu. Le diagnostic clinique de l’érythème migrant est très positif. précis dans une zone où B burgdorferi est endémique si elle est faite par un personnel de santé expérimenté, mais certains patients avec ce diagnostic peuvent ne pas avoir d’infection à B burgdorferi

Participants au groupe d’étude

Les autres chercheurs du Groupe d’étude sur la maladie de Lyme sont les suivants: Diane Holmgren, Kathy O’Keefe, Susan Bittker, Denise Cooper et Charles Pavia, PhD Division des maladies infectieuses et du Département de médecine, New York Medical College et Westchester Medical Center, Valhalla , New York; et Mohammed Bagheri, MD, Jennifer Geiger, MD, Anne Hardick, MD, Matthew Harris, MD, Pamela Jakubowicz, MD, Doug Melman, MD, Jonathan Nelson, MD, Alexander Nicolaides, MD, Daniel Radin, MD, Jeffrey Rebish, MD , et Karen Stolman, MD Division des maladies infectieuses et du département de dermatologie, New York Medical College et Westchester Medical Center, Valhalla, New York

Remerciements

Nous remercions Eleanor Bramesco et Lisa Giarratano pour leur aide