Traumatologie Séparation des énantiomères des produits de réaction de Betti: configuration et inhibition absolues de la neurotoxine botulinique A

Séparation des énantiomères des produits de réaction de Betti: configuration et inhibition absolues de la neurotoxine botulinique A

Nous avons récemment rapporté l’identification de 8-hydroxyquinoléines substituées en 7 (par exemple, 1), des produits de la La réaction de Betti2 est à l’origine d’une condensation des bases de Schiff avec le 2-naphtol, 3,4 mais elle a ensuite été étendue à d’autres substrats aromatiques nucléophiles, par exemple la 8-hydroxyquinoline5. un centre chiral est formé dans cette réaction, les produits sont typiquement des mélanges racémiques, car les réactifs sont habituellement achiraux (Schéma 1). Au fil des années, plusieurs efforts ont été déployés pour résoudre les racémates produits de Betti, dont la plupart consistaient à préparer des sels diastéréoisomères avec des acides chiraux.6 La Chromatographie chirale 1 semblait une alternative évidente pour la résolution de ces racémates, mais nous avons examiné six colonnes chirales et 18 méthodes différentes avant d’observer une résolution suffisante des deux énantiomères sur une colonne Chiralcel OD pour permettre une purification semi-réparatrice de quantités adéquates de (+) – 1 et (−) – 1 pour évaluation dans nos essais biologiques et attribution de configuration (Figures S1 et S2 de l’information de support). La comparaison initiale de l’activité inhibitrice du sérotype A (BoNT / A) de la neurotoxine botulique des énantiomères (+) et (−) de 1 a été réalisée par un test basé HPLC À notre grande surprise, les deux composés présentaient des valeurs de CI50 similaires, 1,0 et 1,1 μ M pour (+) – 1 et (−) – 1, respectivement. Nous avons ensuite évalué leur potentiel à inhiber l’activité biologique de l’holotoxine BoNT / A dans les cellules de neuroblastome murin N2a.1 Aucune différence n’a été observée en pourcentage d’inhibition (P > 0,05) du clivage de SNAP-25 pour les énantiomères et le racémate (±) – 1 aux quatre concentrations testées (60, 45, 30 et 15 μ M). Nous avons ensuite examiné l’efficacité de ces composés dans les préparations d’hémidiaphragme du nerf phrénique de la souris (MPNHDA) .1 Similairement aux observations en CLHP et aux dosages cellulaires, les deux (+) – 1 et (−) – 1 étaient équipotents (P = 0,94) dans le test à base de tissu. Aux concentrations de 2 μ M, les deux énantiomères sont considérablement retardés (P = 1,58 × 10 − 8 et 2,30 × 10 − 6 pour (+) – 1 et (−) -1, respectivement) la demi-vie paralytique induite par BoNT / A 3 fois. Les tests comparatifs de (±) – 1 et des deux énantiomères sont résumés dans le Tableau 1. Table 1 Test comparatif de (±) – 1, (+) – 1 et (−) – 1aWe Ensuite, on a assigné la configuration absolue de (+) – 1 et (−) – 1 en comparant les spectres de dichroïsme électronique (CD) calculés et expérimentaux. En prélude, nous avons déterminé la conformation tridimensionnelle de 1 à travers une série d’expériences de RMN. Les résonances de protons et de carbone ont été attribuées à partir d’une combinaison d’expériences COSY, HSQC et HMBC (Tableau S1, Informations de support). De nombreuses interactions NOE ont été observées dans l’expérience NOESY (Schéma 2), avec celles de NH, OH, H6 et H9 fournissant le meilleur aperçu de la conformation du composé. Alors que toutes les données RMN ont été obtenues pour le mélange racémique, l’énantiomère (S) est montré pour faciliter la description de l’analyse structurelle. Le NOE observé entre H6 et H18a, b et l’absence de NOE entre le proton hydroxyle C8 et H18a, b indiquent que le cycle phényle est tourné à partir du C8OH. Le NOE entre l’OH et le NH, ainsi que l’interaction OH et H9, supporte cette conformation. Le cycle phényle prend une position perpendiculaire au système cyclique quinoléine pour minimiser les interactions stériques. Ceci est supporté par les NOE de H18a, b avec H6, H9 et NH. Fait intéressant, H15 et H16 ont tous deux un NOE avec le NH, mais pas avec H9, ce qui suggère que le cycle pyridine est orienté de manière à placer l’azote du cycle vers H9, tandis que H15 et H16 sont projetés. En outre, cela permet au cycle pyridine d’être orthogonal à la quinoléine et au pseudoparallel par rapport au noyau phényle, minimisant davantage les interactions stériques. Une conformation verrouillée du composé due à la liaison hydrogène entre la paire isolée du NH et le proton de l’hydroxyle C8 est hautement probable.Cependant, le nombre élevé de NOE pour le NH (OH, H6, H9, H18a, b et H19a, b) implique que la structure peut ne pas être entièrement rigide.Schéma 2Pour assigner la configuration absolue de (+) – et (−) – 1, leurs spectres CD électroniques 9,10 ont été enregistrés en solution et comparés à ceux calculés en utilisant la méthode DFT (TDDFT) dépendant du temps.11,12 Les énantiomères de 1 montrent des spectres CD presque en miroir dans le méthanol, comme attendu (Figure ​ (Figure1) .1). En raison de la présence de trois chromophores aromatiques différents, ces spectres présentent de nombreuses bandes entre 200 et 350 nm. Pour l’énantiomère (+), la première bande apparaissant dans la région de 280 nm est large et positive, suivie d’une bande négative modérément intense centrée autour de 260 nm et de deux bandes plus fortes, une bande positive à 245 nm et une un spectre négatif d’environ 220 nm.Figure 1CD des énantiomères de 1 dans le méthanol; concentration 4,8 × 10 et # x02212; 5 M. Plusieurs liaisons rotatives dans la structure de 1, affectant le plus directement l’orientation relative des chromophores, ont permis d’obtenir un ensemble fiable de structures d’entrée cruciales pour les calculs de CD. Une recherche conformationnelle préliminaire en mécanique moléculaire a été exécutée avec le champ de force MMFF, en utilisant une géométrie de départ avec une configuration absolue (R) (voir Informations de support pour plus de détails). Toutes les structures à basse énergie obtenues ont été optimisées avec la méthode DFT au niveau B3LYP / 6-31G (d), convergeant vers un ensemble de neuf conformères distincts à 10 kJ / mol. Leurs énergies et populations à 298,15 K ont été estimées avec B3LYP / 6-311 ++ G (d, p) dans le méthanol (modèle de solvant PCM) .13 Les structures DFT à basse énergie ont ensuite été comparées à l’image conformationnelle fournie par les expériences de RMN, en gardant à l’esprit que la coexistence de plusieurs minima de basse énergie rendait discutable l’interprétation des NOE en termes d’une seule conformation. Les structures calculées peuvent être divisées en deux sous-ensembles en fonction de la rotation autour de la liaison C7 & C7. Dans un sous-ensemble (majeur), composé de quatre conformères de plus faible énergie, H9 est dirigé vers l’OH. Au sein de ce sous-ensemble, deux conformères sont particulièrement stables (minimum absolu, population de 30,8% à 298,15 K, deuxième plus bas minimum, + 0,37 kJ / mol, 26,5%, figure &#x200B, figure2); les structures et les énergies relatives pour tous les minima sont indiquées dans les informations de support. Dans le second sous-ensemble (mineur), composé des cinq conformères restants, représentant 25% de la population totale, H9 est de nouveau dans le plan de l’anneau quinoléine mais dirigé vers C6. Ces résultats corroborent les NOE observés que NH et H9 ont chacun avec les structures C8 OH et H6.Figure 2DFT-optimisées pour les plus basses énergies (à gauche) et les plus basses énergies (à droite) de (R) -1. Les calculs TDDFT ont été réalisés en utilisant différentes combinaisons de fonctionnelles hybrides DFT (B3LYP, PBEO, CAM-B3LYP, BH & HYP) et des ensembles de base (SVP, TZVP, aug-TZVP), sous vide. ou dans le méthanol. Les trois ensembles de base ont conduit à des résultats très similaires (en utilisant B3LYP), à l’exception d’un petit décalage rouge observé pour toutes les transitions calculées sur l’augmentation de la taille de base. Il semble que les deux “ standard ” les fonctionnelles B3LYP et PBE0 ont conduit à des énergies de transition calculées sous-estimées par rapport à l’expérience, alors que l’inverse était vrai pour B3LYP (CAM-B3LYP) atténué par Coulomb et HLYP (demi-d-mi-fonctionnel). En regardant, par exemple, à la bande d’absorption mesurée à 250 nm, la longueur d’onde de transition calculée était de 270 et 230 nm avec B3LYP / aug-TZVP et CAM-B3LYP / SVP, respectivement. En dehors d’un décalage de longueur d’onde systématique, la forme du spectre CD calculé était similaire dans tous les cas. Enfin, l’inclusion du modèle de solvant dans les calculs CAM-B3LYP / SVP n’a pas sensiblement modifié les fréquences calculées et les spectres. Les calculs TDTDT ont ensuite été effectués sur toutes les structures basse énergie en utilisant les deux combinaisons B3LYP / aug-TZVP et CAM-B3LYP / SVP in vacuo . Les spectres CD résultants ont été pondérés avec les facteurs de Boltzmann respectifs (estimés à partir des énergies internes B3LYP / 6-311 + G (d, p) dans le methanol) à 298,15 K et additionnés pour donner des spectres moyens pondérés. Dans tous les cas, les structures d’entrée ont une configuration absolue (R). Figure ​ Figure 33 affiche les spectres calculés avec les deux méthodes pour la structure d’énergie la plus basse et les moyennes pondérées sur neuf structures. Outre le décalage de longueur d’onde déjà discuté (pris en compte par une correction de fréquence dans la figure 3), les formes globales des quatre spectres sont assez similaires, en particulier dans la région de basse énergie (où les calculs TDDFT sont intrinsèquement plus précis) .15 Les résultats du CAM-B3LYP / SVP s’accordent particulièrement bien avec le spectre expérimental pour le signe, la position et l’intensité des bandes (+) – 1 (Figure 3b) .3b). Par conséquent, la configuration absolue des énantiomères du composé 1 peut être attribuée en tant que (+) – (R) -1 et (−) – (S) -1.Il faut noter que le spectre CD moyen calculé est la superposition de spectres de composantes très hétérogènes; ainsi, les bandes apparentes sont en fait la convolution de plusieurs transitions (information de support). Les spectres de la figure 3CD calculés pour (R) -1 avec deux méthodes TDDFT: (A) B3LYP / aug-TZVP; (B) CAM-B3LYP / SVP. Lignes bleues: spectres calculés pour la structure DFT de plus basse énergie (divisés par 2 pour une meilleure comparaison). Lignes noires: moyennes de spectres calculées pour neuf … L’observation inattendue d’activité inhibitrice BoNT / A pratiquement équivalente pour les énantiomères dans trois essais biologiques différents nous a incités à examiner l’état lié des ligands pour rationaliser l’absence apparente de discrimination. Compte tenu de l’activité pharmacologique observée, nous avons émis l’hypothèse que les deux énantiomères lient BoNT / A, vraisemblablement dans le site actif contenant Zn2 +. Néanmoins, des observations expérimentales suggèrent que la liaison d’un ligand similaire n’est pas exclusivement due à la chélation Zn2 ​​+ .16 Pour tester cette hypothèse, nous avons évalué les énergies libres de liaison pour les énantiomères en effectuant des simulations d’intégration thermodynamique avec la dynamique moléculaire17. pour plus de détails). Parce que l’état de protonation du ligand lié est inconnu, nous avons supposé que les deux énantiomères lient le site actif Zn2 + sans ionisation du groupe OH. En utilisant 10 conformations stables les plus basses de chaque ligand, nous avons généré des conformations complexes correspondantes en superposant le fragment de quinoléine sur un complexe de matrice dérivé de AutoDock4.0.18 − 21 Les calculs résultants ont indiqué que l’énantiomère S (− lier BoNT / A de 3,8 ± 2,4 kcal / mol plus favorablement que sa contrepartie (+) -R. L’écart-type important dans les calculs d’énergie libre indique une variabilité significative dans les ensembles conformationnels des ligands liés. Pour analyser la variété des modes de liaison de (+) – R-1 et (−) – S-1 à BoNT / A, ainsi que les fonctions de liaison correspondantes, nous avons effectué un clustering de type GROMOS22 de la simulation épargnée trajectoires à l’état physique pour chacune des 10 configurations de départ des complexes (R) et (S). (Le tableau S3 de l’information de support résume les 16 caractéristiques les plus importantes décrivant les deux ensembles et comprenant les interactions de liaison H, les liaisons de coordination à l’ion Zn2 ​​+ et les interactions π − π) Les caractéristiques les plus robustes inclure des liaisons de coordonnées des atomes O, N1 (quinoléine) et N12 (pyridine) à l’ion Zn2 ​​+. En fonction du nombre de liaisons, le ligand peut être monodenté ou bidenté. Lorsque O et N12 chelent le Zn2 +, l’atome N10 (amine) est amené suffisamment près du Zn2 + pour que ce mode de coordination puisse être considéré comme tridenté. L’interaction de H-liaison la plus commune est celle du groupe OH coordonné avec le carboxyle de E224. L’analyse de clivage des trajectoires des complexes ligand de protéine a capturé la diversité des modes de liaison qui peuvent être décrits par quelques caractéristiques. La plupart de ces caractéristiques sont communes aux deux énantiomères et se rapportent à des interactions spécifiques du ligand avec les résidus du site de liaison. Nous avons trouvé que l’ensemble (−) – S-1, en moyenne, a plus de fonctionnalités d’interaction par cluster, 3,6 par rapport à 3,0 pour celui de (+) – R-1. De plus, l’ensemble (−) – S-1 a un plus grand nombre d’interactions uniques avec le site actif comparé à celui du (+) – R-1. Ces observations sont cohérentes avec la différence d’énergie libre de liaison calculée. La figure 44 illustre des exemples du mode de liaison probable pour chaque énantiomère.Figure 4Exemples de modes de liaison pour l’énantiomère (R) -énantiomère (A) et (S) -énantiomère (B). Les résidus du site actif (jaune) de la protéine (vert) participent à la liaison du Zn2 + (magenta) et du ligand (gris). Les couleurs bleues et rouges correspondent à l’oxygène et à l’azote .. bpco. Seules quelques interactions existent qui permettent de différencier les deux énantiomères. En particulier, l’interaction N10H n’est réalisée que par l’énantiomère (R), alors que les interactions OH-Y366, N12 &#x02212, F163 (NH) et Ar: Phe-Y366 ne sont réalisées que par le (S) -énantiomère. ) -énantiomère. Bien qu’il soit possible que différentes réalisations de caractéristiques d’interaction communes par les énantiomères puissent contribuer à la disparité, la quantification de ces différences pourrait être décourageante. Le fait que nos calculs favorisent la liaison BoNT / A par le (−) – S-1 suggère que, en réalité, les ligands pourraient se lier différemment. Contrairement aux mesures expérimentales, nos valeurs calculées fournissent une évaluation plus limitée des affinités de liaison relatives des deux énantiomères dans des hypothèses spécifiées. Il est également possible que le ligand puisse subir une épimérisation, similaire à celle de l’ibuprofène23,24 en présence de certaines enzymes.25En conclusion, nous avons séparé les énantiomères de 1 (HPLC chirale), établi leur structure chimique (RMN) et leur configuration absolue (CD, modélisation moléculaire), évalué leur activité inhibitrice de BoNT / A et exploré leurs motifs d’ancrage avec BoNT / A LC. À notre connaissance, il s’agit de la première utilisation de calculs de CD pour attribuer la configuration absolue des énantiomères de produit de réaction de Betti. Alors que la chromatographie chirale a récemment été appliquée à la séparation des produits Betti à base de naphtol, 26,27 est la première séparation de ce type de produits Betti composé de 8-hydroxyquinoline, un aryle aldéhyde et une aryl amine.While, dans une grande majorité de Dans certains cas, un énantiomère d’un médicament racémique ou d’un candidat médicament a une activité pharmacologique significativement plus élevée que l’autre, comme cela a été récemment démontré pour un inhibiteur de BoNT / A28, nous avons trouvé une activité inhibitrice BoNT / A essentiellement équivalente dans (+) – (R ) -1 et (−) – (S) -1. Cependant, cette découverte inattendue peut être expliquée par les motifs d’accostage proposés pour les deux ensembles d’énantiomères, mais presque équivalents en énergie. Nous cherchons actuellement à confirmer ces modèles de liaison en cristallisant chaque énantiomère dans le site actif de BoNT / A.