Prothèses Novel Polymère d’ADN pour le pré-ciblage d’amplification

Novel Polymère d’ADN pour le pré-ciblage d’amplification

Généralement, les stratégies ciblées

livraison de radionucléides thérapeutiques ou d’imagerie aux sites tumoraux sont

divisé en deux approches: une où le radionucléide est directement

attaché à l’agent, et l’autre où une tumeur non radioactive spécifique

agent portant un groupe moléculaire avec une forte affinité pour un petit effecteur

molécule est d’abord administrée, avec l’effecteur radiomarqué par la suite

donné après un intervalle approprié pour permettre le ciblage et la clairance de la tumeur.

En tant qu’injection séparée, effecteur radiomarqué peut être effacé rapidement

du sang et du corps, améliorant potentiellement la localisation du signal

dans la tumeur et la toxicité décroissante. Par conséquent, le pré-ciblage a été

largement utilisé comme stratégie active pour augmenter le ratio tumeur-non-tumeur,

afin d’améliorer l’efficacité diagnostique et thérapeutique.1 − 6 Actuellement, plusieurs systèmes sont en cours d’investigation pour le préciblage,

y compris (strept) avidine / biotine, anticorps bispécifiques / haptène, et

mAbMORF / cMORF.2,7,8Une approche de préciblage d’amplification, où un polymère avec plusieurs

des copies d’une cible ont été administrées entre l’anticorps pré-ciblé

et l’effecteur marqué, a donc été développé avec le potentiel de

augmenter considérablement l’accumulation absolue d’un radioactif ou de fluorescence

signal dans la tumeur ou d’autres lésions.9 − 15 En vertu de pré-ciblage d’amplification, les signaux radioactifs de

la concentration sera amplifiée lors des examens PET ou SPECT,

bénéficiant de la localisation de petite focalisation, par conséquent, en faveur

de diagnostic précoce et de traitement rapide. Ainsi, loin, pré-ciblage d’amplification

Les études se concentrent généralement sur des polymères tels que la polylysine et les dendrimères.10 Cependant, les polymères oligomères n’ont pas été pris en compte.

dans le pré-ciblage d’amplification, malgré que les oligomères possèdent de nombreux

avantages par rapport aux anticorps bivalents conventionnels ou à la streptavidine / biotine

paires d’affinité. La flexibilité permet la manipulation de la séquence de base

ou longueur de chaîne pour améliorer l’affinité; Pendant ce temps, la capacité antioxydante

est utile pour inactiver les radicaux libres. Ici, nous développons

une approche de préciblage d’amplification où un nouveau polymère d’ADN contenant

un certain nombre de deux brins d’ADN phosphorothioate (PS-ADN), un pont

et un brin cible, a d’abord été conçu (Figure ​ Figure 11). PS-DNA est utilisé comme effecteur d’amplification

ici parce qu’il est bien connu pour être plus stable in vivo que le phosphodiester

ADN (PO-ADN). Figure 1 (A) Conception de pré-ciblage d’amplification portant des polymères d’ADN.

(B) Zoom sur la section du cadre bleu dans le panneau A. Comme démontré sur la figure ​ Figure 11, un anticorps monoclonal CC49 a été choisi comme le pré-ciblage

anticorps parce qu’il pourrait reconnaître un antigène Sialyl-Tn unique présent

sur la mucine associée à la tumeur, TAG-72, surexprimée sur les types de tumeurs16,17, y compris la tumeur LS174T (lignée cellulaire du cancer du côlon humain) 18,19. Pour plus de commodité, notre anticorps standard anti-ciblage antiTag72 CC49

a été utilisé déjà conjugué avec notre amélioration d’affinité standard

système, c’est-à-dire, 18-mer MORF20 (phosphodiamidate

morpholino, un oligomère d’analogue d’ADN) “ anticorps cible &#x0201d ;,

employant un linker commercial Hydralink suivant les instructions

du fabricant et des expériences dans ce laboratoire.21 polymères d’ADN ont été conçus comme une alternance

de brins de pontage

et les brins cibles hémostase. Le brin de liaison et le brin cible ont tous deux été

conçu pour éviter l’auto-hybridation et les épingles à cheveux, et s’allonger

en fonction des rapports molaires. Le brin de pontage consistait en deux

séquences d’ADN identiques contre le MORF standard 18-mer sur l’anticorps

(c.-à-d., ADNc18 / ADNc18). Les 5 ′ -to-3 ′ direction de la

La polymérisation d’ADN a été changée en 3 ′ à 5 ′ au milieu.

Le brin cible se composait de deux ADN à chaque extrémité d’un polymère unique “

target &#x0201d ;, dans ce cas, un ADN 18-mère (ADNt) a été inséré, c’est-à-dire,

ADN18 / ADNt18 / ADN18. Lorsqu’ils sont mélangés en solution, les brins de pontage

alterner avec les brins cibles pour produire une chaîne de polymère, qui

s’hybriderait à l’anticorps attaché et fournir comme prévu

de nombreux sites de liaison exposés (ADNt) qui étaient prêts à réagir avec

effecteur radiomarqué.La cible de polymère “ unique ”

sur le brin cible

devrait être distinguée de la cible d’anticorps “ ” séquence

(c’est-à-dire, 18-mer MORF ici) sur l’anticorps. En général, toute longueur de chaîne

ou toute séquence cible de polymère qui ne s’hybride pas à ce qui précède

les séquences peuvent être sélectionnées. Pour plus de commodité, un ADN-PS sens 18-mères

a été choisi. Permettre le radiomarquage de la cible polymère “ &#x0201d ;,

un ADN AS 18-mère complémentaire de la cible polymère 18-mère &#x0201c ”

a été conjugué à NHS-MAG3 (mercapto-acétylglycyl-glycyl-glycine)

pour le radiomarquage au 99mTc pour obtenir l’ADN de 99mTc-AS

(c’est-à-dire 99mTc-MAG3-18-mer AS DNA) après la

méthode similaire à celle décrite précédemment. 2299cTc-ADNc (c’est-à-dire, 99mTc-MAG3-ADNc18,

sur lequel les séquences d’ADN a été jumelé avec le MORF standard 18-mer sur

l’anticorps) appliqué dans le pré-ciblage conventionnel a été sélectionné

le contrôle de référence. Les radiochromatogrammes HPLC typiques de 99mTc-ADNc et ADN 99mTc-AS déterminés par l’exclusion de taille

La CLHP a montré que l’efficacité du marquage dans les deux cas était d’environ 95% (figure ​ figure 22). Figure 2 Chromatogrammes HPLC à exclusion de taille

de 99mTc étiqueté

ADNc et ADN AS. Les formations de polymère,

comme la taille relative et la pureté, étaient

estimée par HPLC d’exclusion de taille en utilisant la détection UV à 265 nm, et

en outre analysé par électrophorétique mobilité shift test (EMSA).

Le polymère a été préparé in vitro en mélangeant le pontage

et brins cibles à différents rapports molaires (1: 1, 1: 2, 2: 1, 5: 1,

1: 5, 1:10, 10: 1). Comme indiqué dans la figure ​ Figure33A, lorsque le ratio de brin cible a augmenté

grandement (B / T = 1/5 ou 1/10), le temps de rétention est presque le même

comme celle du brin cible solo. Comme le montre la figure ​ Figure33B, la taille du polymère était la plus grande (environ 125 pb)

quand B / T = 1/2. Cependant, considérant que les brins restants pourraient

auto-hybrider ou former des structures en épingle à cheveux dans le cas de rapports inégaux,

ce qui influencerait la formation, les polymères en condition d’égalité

rapport molaire (1: 1) sont toujours le choix optimal et utilisé dans l’analyse de liaison in vitro ultérieure.Figure 3Size-exclusion HPLC chromatogrammes de polymères

préparé à différents

ratios molaires de pontage à brin cible avec détection UV à 265

nm (A) et électrophorétique mobilité résultats d’essai de décalage (B) avec des références

à gauche (50, 100, 150, 200, 250, 300, … L’efficacité de liaison a été mesurée par détection de radioactivité

Suivant

addition d’ADN de 99mTc-AS trace. Liaison totale aux polymères

a été observé, quel que soit le rapport molaire du brin de pontage et de la cible

brin. De plus, sur la figure 44, un pic de radioactivité unique a été observé pour chaque polymère

après hybridation avec l’effecteur radiomarqué, qui a également indiqué

la taille uniforme formée lorsque le rapport molaire individuel différent était

Les chromatogrammes HPLC de taille-exclusion de polymères préparés à différents

rapports molaires de pontage sur le brin cible avec détection de la radioactivité

Après addition de l’ADN trace 99mTc-AS. Ensuite, la preuve de concept a été réalisée in vitro sur une plaque à fond plat de 96 puits revêtue de Protein L

en utilisant un polymère

préparé dans un ratio de pontage / brin cible de 1: 1, où CC49 peut être

reconnu par la protéine bactérienne liant les immunoglobulines L. La figure 55 présente le pourcentage

de la radioactivité pour le préciblage par amplification et le pré-ciblage conventionnel.

Probablement en raison de la grande importance de cette étude, le résultat de

le reciblage conventionnel (mesure 2) n’est pas statistiquement différent

celui du contrôle 1 (mesure 1). L’addition de l’ADN de 99mTc-AS

améliore généralement l’efficacité du ciblage (barres 3 – 5); de plus,

les radioactivités augmentent davantage lorsqu’on ajoute à la fois du polymère et de l’ADN de 99mTc-AS (barres 4 et 5). Par rapport au pré-ciblage conventionnel

(barre 2) et autres contrôles (barres 1, 3 et 4), amplification complète

le pré-ciblage (mesure 5) améliorerait significativement le signal radioactif,

qui est environ deux fois plus élevé que le pré-ciblage classique, ce qui suggère

que le polymère d’ADN joue un rôle important dans l’accumulation de la radioactivité

dans ce cas.Figure 5Histogrammes présentant le pourcentage sur

radioactivité obtenue

dans une plaque enduite de protéine L pour pré-ciblage d’amplification et classique

pré-ciblage. Les résultats étaient des moyennes, les barres d’erreur présentent un SD (N = 6). En outre, l’effet de pré-ciblage d’amplification

était aussi

confirmé dans une étude d’amplification de signal cellulaire en utilisant un polymère préparé

dans un ratio de pontage / brin cible de 1: 1. Comme le montre la figure ​ Figure66, la tendance de l’amplification du signal

sur LS174T est similaire à celle sur la plaque revêtue de protéine L (Figure ​ Figure 55). Accumulation de radioactivité

du pré-ciblage d’amplification (mesure 5) est presque deux fois plus

de la conventionnelle sans polymère (barre 2), qui est le direct

réflexion de la formation de polymère.Figure 6Histogrammes présentant

le pourcentage de radioactivité accumulé

dans des cellules LS174T pour le pré-ciblage d’amplification et le pré-ciblage conventionnel.

Les résultats étaient des moyennes; barres d’erreur présentent un SD (N = 4). En conclusion, un nouvel oligomère

(pontage et brins cibles inclus)

a été conçu pour former un polymère avec des longueurs variables. Après le premier

déterminer le rapport molaire approprié (1: 1) du pontage et de la cible

brin par exclusion de taille HPLC et EMSA, le polymère a été utilisé pour

produire plus de sites de liaison (cibles) qui seraient reconnus par le

effecteur. Cette hypothèse a donc été bien vérifiée par le

expérience in vitro d’amplification de signal dans la liaison d’anticorps

plaque enduite de protéine L et cellules LS174T. Les deux études de cette nouvelle

approche de pré-ciblage affiché deux fois plus haut signal radioactif

augmentation que la technologie conventionnelle, démontrant que

signal pourrait être amplifié en important plus d’isotopes radioactifs

ADN en vertu de l’hybridation avec plus de cibles sur le polymère. Donc,

cette enquête a démontré une nouvelle preuve de concept jusqu’à présent, qui

sert de paradigme utile du potentiel des polymères oligomères

pour améliorer le pré-ciblage et d’autres approches apparentées.