Puissance Classement Ligand Affinity pour le DNA Minor Groove par Expérimentation et Simulation

Classement Ligand Affinity pour le DNA Minor Groove par Expérimentation et Simulation

DNA minor groove binders (MGB) ont un potentiel thérapeutique dans une gamme de conditions, y compris le cancer et microbien infection. La sélectivité des grandes MGB en polyamide en épingle à cheveux pour des séquences d’ADN spécifiques est bien documentée 1, mais la véritable sélectivité des séquences pour les petites MGB est moins bien établie. En comprenant mieux les règles qui régissent la liaison étroite et côte-à-côte de ligands de faible poids moléculaire (MW ∼ 500) dans la rainure mineure de l’ADN, il devrait être possible de développer des approches adaptées à la conception de médicaments. Le développement de MGBs est parti de l’observation que la netropsine et la distamycine, grâce à leur isohélicité naturelle, se liaient sélectivement dans la rainure mineure de l’ADN par une combinaison de liaisons hydrogène sur les bases des rainures et des interactions de van der Waals avec les parois des rainures. # x02212; 5 Une percée significative dans le domaine est venue de l’observation qu’un certain nombre de MGB pouvaient se lier dans la rainure mineure en tant que complexe 2: 1 côte à côte avec une sélectivité de paire de base.5 Alors que l’hydrogène se liait au sol rainuré En outre, l’équilibre entre les contributions enthalpiques et entropiques à la liaison MGB fait l’objet de recherches approfondies et semble varier avec la structure MGB et la séquence de liaison. de l’ADN.9 Au cours des 10 dernières années, nous avons préparé une bibliothèque de plus de 200 MGB composés de groupes hétérocycliques et de groupes tête / queue qui cherchent à La capacité de liaison hydrogène du sol rainuré permet à la fois d’obtenir une spécificité et d’exploiter la nature lipophile des parois des rainures pour améliorer l’affinité.10 − 13 De manière significative, nous avons découvert que les groupes hétérocycliques N-alkyle ou C-alkyle peuvent jouer un rôle crucial en prolongeant le cadre de lecture du ligand de quatre à six paires de bases. Le premier exemple bien caractérisé de cet effet a été nos études détaillées par spectroscopie RMN, 11 calorimétrie isotherme (ITC), et la modélisation moléculaire14 de la liaison de haute affinité entre le duplex d’ADN d (CGACTAGTCG) 2 et la thiazotropsine A 1. Nos données d’empreinte15 ont montré que la séquence générique 5 ′ -XCYRGZ-3 ′ Ces altérations des bases flanquantes du cadre de lecture d’ADN pour 1 ont des conséquences subtiles sur la liaison15 et n’ont pas été expliquées en termes structurels ou énergétiques, mais Pour déterminer les raisons de ce comportement par 1, nous avons examiné son interaction avec les oligodésoxynucléotides (ODN) contenant différentes bases flanquant autour de la centrale 5 ′ -CTAG-3 &#x02032 ; motif en utilisant une combinaison de spectroscopie RMN, ITC, et la simulation moléculaire. Nous décrivons pour la première fois un protocole de simulation rapide et efficace qui peut classer les affinités de liaison pour les ligands de liaison 2: 1 côte à côte.Analyse des données RMN 1H pour le complexe entre 1 et 5 ′ – CGACTAGTCG-3 ′ (Figure ​ (Figure 1a) 1a) avait déjà établi qu’une liaison de rainure mineure se produisait avec un motif de liaison côte-à-côte décalé de 2: 1, tête-bêche16,17 au cadre de lecture indiqué (souligné).11 Le même motif de résonance RMN caractéristique se produit également pour la liaison de 1 aux deux 5 ′ -d (CGTCTAGACG) -3 ′ et 5 ′ -d (CGGCTAGCCG) -3 ′ (Figure 1b, c, 1b, c, respectivement), qui produisent tous des ensembles de données de RMN nucléaire Overeaser (NOESY) à deux dimensions (2D) de qualité exceptionnelle. 5 & ​​# x02032; -d (CGCCTAGGCG) -3 ′ peut au mieux être décrit comme “ pauvre &#x0201d ;, étant caractérisé par de larges résonances RMN (Figure ​ (Figure1d) 1d) et mal défini croissances croisées dans les spectres NMR 2D NOESY Nos données suggèrent que, bien que la liaison de l’ADN se produise entre 1 et 5 ′ -CCTAGG-3 &#x02032 ;, le complexe formé est “ desserré ” .Figure 1Sections de 1D 1H Spectres RMN après mélange de 2 équivalents molaires de thiazotropsine A avec les oligonucléotides auto-complémentaires (a) d (CGACTAGTCG) 2, (b) d (CGTCTAGACG) 2, (c) d (CGGCTAGCCG) 2, (d) d (CGCCTAGGCG) 2, et (e) d (CGCCTAGICG) 2. Notre évaluation par l’ITC (pour les détails expérimentaux complets, voir l’information de support) de la liaison entre 1 et les quatre différentes séquences en question a confirmé les influences subtiles du flanc CTAG ng séquences en termes thermodynamiques (figure ​ (figure 22 et figure S2 et tableau S1 dans l’information de support); les trois séquences qui produisent des ensembles de données NMR 2D NOESY de haute qualité présentent des énergies libres de liaison significativement plus favorables avec 1 que 5 (CGCCTAGGCG) -3 &#x02032 ;, qui reflètent une liaison d’affinité inférieure par cette dernière séquence observée par RMN. En effet, l’enthalpogramme de cette séquence, lorsqu’il est titré avec 1, ne présentait pas les courbes caractéristiques d’inflexion raide qui caractérisent les ligands minuscules de liaison aux ODN (figure 22). Figure 2 Titrages ICIT de séquences de thiazotropsine A à ODN dans le tampon PIPES à 25 ° C (pH 6,8). (A) Données brutes pour le titrage de la thiazotropsine A en d (GCGCCTAGGCGC) 2 (à gauche) et d (GCGCCTAGICGC) 2 (à droite) (B) Enthalpogram extrait de A et corrigé. Sur la base des spectres RMN de haute qualité pour les séquences de liaison efficaces avec 1, nous avons pu produire des coordonnées pour les complexes11 (manuscrit en préparation) En l’absence d’un ensemble de données équivalent pour 1 liaison avec 5 ′ – d (CGCCTAGGCG) -3 &#x02032 ;, nous avons examiné ces complexes pour identifier la raison d’une mauvaise liaison.Nous avons reconnu le groupe amino exocyclique de G8 dans la rainure mineure de l’ADN comme créant un encombrement stérique au voisinage de la queue de diméthylaminopropyle (Dp) 1. Nous avons donc proposé, comme d’autres ont d un, 19 que l’élimination du NH2 exocyclique de G8 (c’est-à-dire, le remplacement de G8 dans 5 ′ -d (CGCCTAGGCG) -3 ′ par inosine, I8) restaurerait la qualité de la formation du complexe dans un mélange 2: 1 avec 1. Comme le suggèrent les données, la liaison entre 1 et 5 ′ -d (CGCCTAGICG) -3 ′ tombe dans la même classe que tous les précédents complexes de liaison étroite (Figure ​ (Figure1e) .1e). Les diagrammes caractéristiques dans les données de RMN (en particulier le déplacement chimique 31P du phosphore 3 à T5 au ppm maximum, figure S1 dans l’information de support) indiquent que le complexe formé entre 1 et 5 ′ -d (CGCCTAGICG) -3 ′ ressemble à cela pour 5 ′ -d (CGACTAGTCG) -3 &#x02032 ;. L’analyse par ITC a confirmé que le remplacement de G8 par I8 dans la séquence était thermodynamiquement favorable pour la liaison 1 (figure 22 et tableau S1 dans l’information de support) et, en fait, produit le complexe le plus stable des cinq séquences. Comme souvent rencontré avec les interactions biomoléculaires, nous avons observé une compensation d’enthalpie pour la liaison de 1 aux différents ODN (Figure S3 dans les Informations de Soutien.) Pour les systèmes où la liaison semble être enthalpique, cet effet de compensation pourrait être expliqué par un réseau de liaison fort qui implique la séquestration de molécules d’eau du volume désordonné (donc une entropie défavorable) .20 Pour les séquences où l’entropie devient plus influente et l’enthalpie moins importante, le complexe est moins retenu conformationnellement, et la libération plutôt que la l’ordre de l’eau est devenu plus important. Pour examiner ces complexes plus en détail, nous avons soumis les structures résolues à la dynamique moléculaire ( MD). Notre première tentative a consisté à effectuer des calculs MD / MM-PBSA (mécanique moléculaire Poisson − surface de Boltzmann) pour obtenir des données absolues sur l’énergie libre de liaison pour une liaison 2: 1 côte à côte d’un ligand avec l’ADN.14 simulations de liaison pour la complexation de 1 avec le duplex d’ADN 5 ′ -d (CGACTAGTCG) 2-3 &#x02032 ;, la méthode optimale reposait sur une approche de trajectoire séparée (formes complexes et non liées simulées séparément) en utilisant de l’eau explicite avec l’AMBER polarisable champ de force ff02.14 La forte demande de calcul de cette approche ne se prête pas facilement à l’analyse et à la comparaison de complexes multiples.Nous avons donc exploré l’utilisation de MD implicite moins coûteuse, qui serait applicable aux programmes de découverte de médicaments qui contiennent de grandes bibliothèques de ligands, comme la nôtre. Nous avons utilisé les coordonnées générées par nos études RMN pour explorer si les simulations MD implicites pouvaient reproduire l’ordre de liaison de 1 dans les complexes de liaison étroite avec 5 ′ -d (GCGACTAGTCGC) 2-3 &#x02032 ;, 5 ′ -d (GCGTCTAGACGC) 2-3 et # x02032 ;, 5 ′ -d (GCGGCTAGCCGC) 2-3 ′ et 5 ′ -d (GCGCCTAGICGC) 2-3 &#x02032 ;. L’association libre entre 5 ′ -d (GCGCCTAGGCGC) 2-3 ′ et 1 (Figure ​ (Figure1d) 1d) signifie qu’aucune coordonnée n’a été générée pour cette séquence. Pour examiner l’efficacité des différents modèles GB (généralisé Born) dans AMBER, nous avons comparé un algorithme de détramage par paires standard [HCT, implicite GB (igb) = 1] 21 et une version modifiée par Onufriev et ses collègues [OBC (II) , igb = 5] .22 Un champ de force non-polarisable (FF03) 23 dans AMBER a été utilisé pour toutes les simulations MD. Les deux modèles de solvatation GB (igb = 1 ou 5) ont été appliqués en utilisant la dynamique de Langevin avec une fréquence de collision égale à 1 tout au long des simulations de 10 ns. La température a été maintenue à 300 K. Les énergies libres de liaison étaient la moyenne de 100 instantanés pris à partir des 5 dernières ns des simulations MD implicites. Seulement 10 instantanés de la dernière période de nanosecondes ont été conservés pour l’analyse en mode normal (NMA) afin d’évaluer l’entropie. Les protocoles de simulation complets peuvent être trouvés dans les informations de support. Nos études RMN et ITC ont indiqué la présence de seulement la structure complexe 2: 1 au cours du titrage avec le ligand; en effet, toutes nos études expérimentales n’ont jusqu’à présent trouvé aucune évidence pour la formation d’un complexe initial 1: 1 avant liaison 2: 1 et que les ligands de type thiazotropsine se comportent comme des dimères tête-à-queue en solution, et les monomères ne sont pas présents En accord avec notre étude précédente, nous avons donc utilisé le cycle thermodynamique représenté sur la Figure 33 et exprimé les paramètres qui peuvent être calculés en utilisant la méthodologie MM-PBSA pour obtenir des énergies libres de liaison. ligands avec divers ODN en résolvant les équations 1 − 3.123Figure 3 Cycle thermodynamique pour l’association du dimère de thiazotropsine A (L2, nuances de bleu) avec les duplex 5 ′ -d (GCGACTAGTCGC) 2-3 ′ (D, rouge). La comparaison des énergies libres relatives expérimentales et simulées (Δ Grel) 25 de la liaison du ligand dimère avec l’ADN est représentée sur la figure 44 (les valeurs expérimentales et théoriques réelles sont résumées dans le tableau 1). et tableau S2 dans les informations de support) cliquez ici pour acheter. Nos résultats indiquent que Δ Grel des simulations MD implicites (igb = 5) de la trajectoire unique reproduit l’ordre de classement de l’affinité (CCTAGI > ACTAGT > TCTAGA > GCTAGC) et représente le premier rapport d’une méthode de simulation qui peut classer les énergies libres de liaison de ligand 2: 1 en accord avec l’expérience. En outre, il est également efficace sur le plan des calculs, 14 fois plus rapide que le MD explicite (en utilisant 16 processeurs en parallèle sur les ordinateurs du National Grid Service du Royaume-Uni). La méthode utilisant igb = 1 classe le système contenant CCTAGI comme ayant la plus mauvaise affinité mais conserve les trois autres séquences dans le bon ordre (ACTAGT > TCTAGA > GCTAGC > CCTAGI). Sur la base de ces résultats, seule la mise en œuvre plus récente (igb = 5) a été développée plus loin. Figure 4 Gauche: énergies libres de liaison relative pour 1 lié aux différents ODN basé sur l’expérience et MD implicite utilisant igb = 1 et igb = 5. Droite: les énergies liantes relatives de 1, 2 et 3 se lient à d (GCGACTAGTCGC) 2.Table 1Individuelles Enthalpique, entropique, et les termes d’énergie libre obtenus à partir des expériences et des calculs pour 1 liaison avec quatre différents ODNSAFinally, pour déterminer si notre simulation protocole pourrait classer les affinités pour les ligands connexes, nous avons calculé les énergies de liaison pour deux analogues de la thiazotropsine A (2 et 3), que nous avons étudié par ITC, mais pas par RMN. La préparation de 1 et 3 a été décrite précédemment, 10,13 tandis que les détails pour la préparation et la caractérisation de 2 peuvent être trouvés dans les Informations de Support. Les simulations MD implicites (igb = 5) ont donné des valeurs Δ Grel de − 5,0 et − 9,8 kcal / mol pour les analogues 2 et 3, respectivement, liées à l’ODN contenant ACTAGT, et leur classement reflète les valeurs obtenues par ITC (figure ​ (figure 44 et tableau 2) .Tableau 2 Contributions énergétiques de 1, 2 et 3 liaison à d (GCGACTAGTCGC) 2 utilisant implicite MD (igb = 5) et les données expérimentales (méthode ITC ) aExamination des termes enthalpique absolu (Δ Habs), entropique (T Δ Sabs) et énergie libre (Δ Gabs) de 5 ′ -d (GCGACTAGTGCG) 2-3 ′ la liaison à 1 − 3 obtenue à la fois par simulation et par expérience peut aider à donner un aperçu du processus de conception du médicament.Selon le tableau 2, bien que le groupe isopentyle soit enthalpiquement favorable grâce à des contacts lipophiles améliorés selon notre paradigme de conception, la plus grande flexibilité de cette chaîne génère une pénalité entropique plus grande que la compensation par des interactions lipophiles améliorées et réduit ainsi l’affinité de liaison 2 pour l’ODN. De même, la comparaison de 1 avec 3 montre que le remplacement de la queue diméthylamino propyle par un groupe morpholino éthyle est plus favorable enthalpiquement par liaison hydrogène entre l’oxygène morpholine et l’ODN, mais encore une fois, la pénalité entropique nie ce gain enthalpique.En conclusion, alors que notre Le but est d’améliorer la reconnaissance de l’ADN grâce à des interactions lipophiles améliorées, la subtilité de la reconnaissance de l’ADN continue d’être fortement influencée par l’appariement favorable de la forme tridimensionnelle, le partenariat de la liaison hydrogène et les considérations conformationnelles. Nous croyons que les informations fournies par cette étude détaillée seront importantes pour informer la conception et la mise en œuvre de paramètres de modélisation capables d’identifier potentiellement “ good ” et “ mauvais ” liants sur la base des caractéristiques structurales observées ici.