Prothèses Bioessais par diffusion sur disque pour la détection de l’activité antibiotique dans les fluides corporels: applications pour le projet de recherche sur l’étiologie de la pneumonie pour la santé des enfants

Bioessais par diffusion sur disque pour la détection de l’activité antibiotique dans les fluides corporels: applications pour le projet de recherche sur l’étiologie de la pneumonie pour la santé des enfants

Pour tirer des conclusions sur les agents étiologiques putatifs de la pneumonie sévère, le projet PERCH doit être capable d’évaluer objectivement le prétraitement antibiotique chez les participants inscrits. Cette revue se concentre sur le bioessai de diffusion du disque, une méthode de laboratoire simple pour évaluer les antibiotiques récents. Dans cette méthode, un organisme indicateur sensible est utilisé pour détecter l’activité antimicrobienne dans des échantillons de fluides corporels qui ont été inoculés sur un disque de papier filtre et placés sur un milieu de croissance en gélose. Bien qu’il y ait des limites à la méthode de diffusion du disque, son faible coût, sa facilité d’utilisation et sa capacité à détecter largement le prétraitement antibiotique en font une méthode attrayante pour les études épidémiologiques telles que comme PERCH

La détection de l’activité antibiotique dans les fluides corporels est utile pour vérifier les concentrations thérapeutiques des antibiotiques, surveiller la toxicité des médicaments et évaluer l’observance des schémas thérapeutiques. Dans le projet PERCH, la présence d’agents antimicrobiens dans les échantillons de fluides corporels présente un intérêt. en raison de l’interférence potentielle de ces agents avec certains tests microbiologiques Plus important encore, si un traitement antibiotique est reçu avant la collecte des échantillons, les sensibilités des cultures bactériologiques sont réduites En conséquence, les inférences sur l’étiologie pathogène spécifique seront biaisées vers les virus et bactéries résistantes aux antibiotiques Bien que les parents puissent être interrogés sur les antécédents d’utilisation d’antibiotiques de leur enfant, cette information est souvent peu fiable. Prises ensemble, études étiologiques d’enfants souffrant d’infections respiratoires en Argentine , au Pakistan , et L’Uruguay a trouvé une activité antibiotique dans des échantillons d’urine En Thaïlande, une étude a montré que l’activité microbienne sérique est une mesure plus précise du prétraitement antibiotique que les rapports des parents . Pour ces raisons, une méthode de laboratoire simple et fiable pour dépister les antibiotiques. L’activité antibiotique dans les fluides corporels au moment de la collecte des échantillons pour des tests microbiologiques améliorerait l’interprétation des données microbiologiques dans PERCH. Les essais d’activité antimicrobienne dans les échantillons de fluides corporels peuvent être classés en groupes: essais non microbiologiques et essais microbiologiques bioessais Les essais non microbiologiques utilisent des méthodes chimiques et physiques comme la chromatographie liquide à haute performance, alors que les bioessais reposent sur un microorganisme sensible pour indiquer la présence d’un agent antimicrobien. Les bioessais sont plus simples et moins coûteux à réaliser que les tests non microbiologiques et peuvent détecter simultanément plusieurs types d’antibiotiques. Les méthodes de diffusion par disque datent des s , sont peu coûteuses, et peuvent être facilement réalisées dans des laboratoires ayant des capacités de culture bactérienne. Les tests de diffusion sur disque détectent l’activité antibiotique de nombreuses classes, ils sont utilisables lorsqu’il n’est pas nécessaire de déterminer la présence de types ou de concentrations spécifiques d’antibiotiques. La méthode consiste à inoculer de petits disques de papier filtre avec l’échantillon de liquide une plaque d’agar qui a été inoculée avec un organisme indicateur La plaque est ensuite incubée, typiquement pendant la nuit à un échantillon de ° C- ° C avec une concentration suffisante d’antimicrobiens va créer une zone d’inhibition bactérienne lors de sa diffusion à travers l’agar. activité dans le spécimen de fluide corporel Les contrôles positifs et négatifs sont habituellement effectués à Paralle Comme les zones d’inhibition correspondent à une concentration relative du composé antimicrobien, des courbes standard peuvent être créées en utilisant des étalons connus pour obtenir une estimation quantitative de la concentration si le composé spécifique est connu [, En raison des attributs mentionnés ci-dessus, la diffusion sur disque est la méthode choisie pour PERCH. Les méthodes de diffusion sur disque peuvent varier selon de nombreux facteurs: type d’échantillon, organisme indicateur, milieu et conditions d’incubation. sélectionner la méthode de normalisation la plus appropriée parmi les sites d’étude PERCH Cette revue résume les données sur les méthodes de diffusion de disque qui sont contenues dans une variété de publications sur une longue période

HISTORIQUE DE LA METHODE DE DIFFUSION DE DISQUE

Avant l’introduction du test de diffusion sur disque, la méthode la plus courante pour détecter la pénicilline dans les échantillons de liquide corporel était la méthode des plaques cylindriques Cette méthode utilise de petits tubes cylindriques en verre ou en acier inoxydable pour maintenir la substance antibiotique la surface d’une plaque d’agar Des zones d’inhibition dans l’agar ont été mesurées à partir des bords des tubes Une modification de cette méthode utilisant des disques en papier filtre a été rapportée pour la première fois dans la littérature par Vincent et Vincent. Les auteurs ont émis l’hypothèse que la sensibilité améliorée pourrait être due à un contact plus constant de la pénicilline avec la surface de la gélose et une diffusion plus uniforme du disque. Staphylococcus aureus en tant qu’organisme indicateur, ils ont signalé une limite inférieure de détection de / U de pénicilline par millilitre de test flui Une monographie de Grove et Randall décrivait des méthodes de dosage pour tous les antibiotiques couramment utilisés à cette époque, y compris une méthode de plaque à cylindre plus sensible capable de détecter la pénicilline. des concentrations aussi faibles que U / mL avec l’utilisation de Micrococcus luteus anciennement Sarcina lutea comme organisme indicateur Plusieurs chercheurs ont ensuite modifié les méthodes de Grove et Randall pour l’utilisation de disques de papier filtre, en particulier après l’introduction de la gentamicine dans les déterminer les niveaux sanguins pour l’évaluation de la toxicité est devenue plus pressante

VARIATIONS SUR LA MÉTHODE DE DIFFUSION DE DISQUE

Un résumé des méthodes de diffusion du disque pour les échantillons d’urine et de sang rapportés dans la littérature est présenté dans les Tableaux Supplémentaires et Certains rapportent l’utilisation d’une méthode de diffusion du disque pour évaluer l’observance du traitement ou détecter un prétraitement antibiotique non rapporté dans une cohorte épidémiologique. la validation systématique d’une méthode de diffusion de disque spécifique, généralement réalisée de deux façons La première méthode de validation consiste à créer des dilutions en série d’une substance d’essai stérile enrichie d’une concentration connue d’antibiotique [, -] Ceci peut être utilisé pour développer Courbe standard, déterminer les limites inférieures de détection des antibiotiques et estimer la concentration en antibiotique d’un échantillon inconnu La deuxième méthode de validation consiste à doser les échantillons de fluides corporels de sujets humains après leur traitement avec une dose connue d’antibiotique [-,,,,] permet une estimation de l’intervalle de temps pour lequel le bio-essai peut ect de l’activité antibiotique après la dernière dose de traitement Il est également utilisé pour évaluer l’incidence des résultats d’essais biologiques faussement négatifs et faussement positifs dans des échantillons cliniques

CHOIX D’ÉCHANTILLONS D’URINE, DE SÉRUM OU DE PLASMA

Bien que les échantillons d’urine et de sang soient couramment testés pour l’activité antibiotique, l’urine est généralement considérée comme plus sensible que le sérum ou le plasma parce que les composés chimiques sont souvent concentrés dans les urines. Une étude de ce type a comparé l’activité microbienne dans des échantillons de sérum et d’urine d’enfants au moyen d’un test de diffusion sur disque avec S aureus NCTC comme organisme indicateur. Parmi les enfants dont les échantillons d’urine présentaient des zones d’inhibition, seulement% Les zones d’inhibition étaient plus grandes dans les analyses d’urine positives que les analyses sériques positives Une autre étude a évalué l’activité des antibiotiques dans les échantillons de sérum et d’urine des enfants hospitalisés au moyen de S aureus American Type Culture Collection Souche ATCC et détecté l’activité antibiotique urinaire en% de l’enfant n avec sérums négatifs Cependant, les propriétés antimicrobiennes de l’urine ont le potentiel de générer des résultats faussement positifs , et les antécédents d’utilisation antérieure d’antibiotiques étaient inconnus ou disponibles uniquement à partir des rapports parentaux dans les deux études. été noté ailleurs; Dans une étude sur des patients hospitalisés de tous âges en Australie, l’activité antibactérienne dans les échantillons d’urine de% des patients ne pouvait pas être expliquée par un traitement antibiotique antérieur même après une étude approfondie , et dans une étude de spécimens d’urine Activité antibiotique inexpliquée Il y a d’autres avantages de l’urine sur les échantillons de sang, en plus d’une sensibilité accrue L’urine est un échantillon non invasif et son volume n’est pas limité Bien que le volume nécessaire pour l’essai biologique soit faible, le sang est souvent Cependant, l’urine peut être difficile à recueillir chez les nourrissons et les jeunes enfants qui ne peuvent pas produire un spécimen sur commande. Certains chercheurs se fient donc à des échantillons cathétérisés ou ensachés ou à d’autres méthodes de collecte d’urine passive . commodités, il est toujours difficile de prélever un échantillon d’urine avant le début d’un traitement antibiotique, en particulier d’un enfant gravement malade et peut avoir un système circulatoire compromis Dans de telles circonstances, le sérum ou le plasma est recommandé comme un autre spécimen En choisissant entre les échantillons de sérum et de plasma, il y a des considérations théoriques telles que l’influence de l’anticoagulant sur la liaison protéique dans le cas du plasma , mais il n’y a aucune preuve facilement disponible que l’un de ces types d’échantillons est meilleur que l’autre pour les essais biologiques par diffusion sur disque. même essai et résultats identiques signalés Il est important de noter que si le plasma est utilisé comme échantillon d’essai, les étalons de contrôle doivent également être des échantillons de plasma En fin de compte, le choix du type d’échantillon peut être déterminé par des circonstances logistiques

INOCULATION ET STOCKAGE DE PAPIER FILTRANT

La méthode la plus communément décrite d’application de l’échantillon de fluide corporel d’essai sur le disque de papier-filtre typiquement de mm de diamètre consiste à utiliser une pince pour tremper le disque dans le fluide et ensuite presser le disque sur le côté de la bouteille pour drainer tout excès de liquide. Simon et Yin ont trouvé que cette méthode de trempage était insatisfaisante: un disque de papier filtre pouvait absorber – μL de fluide, ce qui entraînait des volumes irréguliers d’éprouvette. Une autre méthode consiste à utiliser une pipette pour faire tomber la quantité de liquide désirée. μL, selon la méthode sur le disque après qu’il a été placé sur la plaque de gélose Il a été suggéré que l’utilisation de micropipettes jetables est moins sujette à erreur de l’opérateur que l’utilisation de pipettes plus grandes, dépendance à l’action capillaire, trempage du papier filtre dans l’échantillon Une grande variété de pratiques pour le stockage du papier filtre inoculé a été rapportée. Certaines études de validation ne signalent aucune perte de sensibilité à la pénicilline après le papier filtre. les voyages sont laissés à température ambiante pendant des jours , alors que d’autres ont trouvé une diminution de% de la concentration en rifampicine après que le papier filtre inoculé soit laissé à température ambiante pendant quelques heures

ORGANISMES INDICATEURS

L’organisme indicateur utilisé dans le bioessai par diffusion de disque dépend de l’utilisation prévue du bioessai. Les tests conçus pour détecter une petite gamme d’agents antimicrobiens peuvent utiliser un organisme avec une sensibilité limitée, alors que les tests conçus pour détecter une large gamme d’agents antimicrobiens utilisent généralement un organisme indicateur largement sensible M luteus, S aureus et Bacillis subtilis sont les organismes indicateurs les plus couramment utilisés M luteus a été le plus souvent utilisé pour détecter la pénicilline , tandis que S aureus et B subtilis sont couramment utilisés pour détecter une large gamme d’antibiotiques D’autres organismes indicateurs communs incluent Escherichia coli et Streptococcus pyogenes, souvent utilisés en combinaison avec d’autres organismes indicateurs pour détecter différentes classes d’antibiotiques

INOCULATION DE LA PLAQUE DE DOSAGE

Il existe des moyens d’inoculer la plaque d’essai avec l’organisme indicateur: une culture de bouillon de culture peut être mélangée avec une seule couche d’agar fondu , ajoutée à une fine couche d’agar qui est étalée sur une couche d’agar solide solide [,,, ], ou striée à la surface de la gélose avec un tampon stérile [,,,] La première méthode de diffusion sur disque recommandait l’utilisation d’un bouillon peptone comme milieu d’ensemencement afin de favoriser une croissance moins diffuse et moins granulaire. est cultivé, la suspension bactérienne peut être normalisée par colorimétrie ou, comme indiqué par des études plus récentes, ajustée à une suspension de McFarland de ou plus communément [,,,]

MILIEU DE CULTURE ET INCUBATION

Les plaques de culture de mm de diamètre sont généralement utilisées pour le bioessai par diffusion de disque et peuvent filtrer les disques de papier à la fois en fonction de la taille des zones d’inhibition utilisées pour définir l’activité des antibiotiques. décrit Il est important d’avoir une couche d’agar d’épaisseur uniforme , et une couche d’agar plus mince peut améliorer la sensibilité du test Le choix du milieu dépend largement de l’antibiotique à doser, comme variation du pH ou La concentration en sel peut avoir un effet sur la capacité de diffusion de l’antibiotique à travers la gélose. L’agar Mueller-Hinton est actuellement le milieu le plus fréquemment utilisé [,,,,,,,] Si une détection antibiotique sélective est souhaitée, au milieu pour désactiver des antibiotiques spécifiques Par exemple, le chlorhydrate de semicarbazide peut être ajouté pour éliminer l’activité de la streptomycine et la β-lactamase peut être ajoutée pour inactiver les pénicillines et les céphalosporines Incubat Les temps d’ionisation sont souvent “pendant la nuit” – heures et parfois jusqu’à heures, bien que des temps d’incubation aussi courts, et heures aient été décrits [,,] La température d’incubation standard est constamment ° C- ° C sauf Bacillus stearothermophilus , auquel cas l’incubation est à ° C [,,]

DÉTECTION D’ACTIVITÉ ANTIBIOTIQUE

Moment de la collecte des échantillons

Dans leur étude des organismes indicateurs, Liu et al décrivent le temps écoulé entre la dernière dose d’antibiotique et la collecte des échantillons comme le facteur le plus important affectant les résultats de la méthode de diffusion du disque informations communes. Durée de détection d’un antibiotique dans l’urine ou le sérum après la dernière dose varie considérablement en fonction de l’antibiotique et de la dose Dans les échantillons d’urine, les antibiotiques β-lactamines et l’érythromycine ont pu être détectés jusqu’à quelques heures après la dernière dose ; la pénicilline peut être détectée jusqu’à plusieurs heures après la dernière dose ; et la rifampicine, la clindamycine, la tétracycline, le cotrimoxazole et la ciprofloxacine ont pu être détectés jusqu’à plusieurs heures après la dernière dose Des résultats faussement négatifs sont donc possibles si la collecte des échantillons est retardée. L’étude de validation du plasma a indiqué que des antibiotiques pouvaient être détectés jusqu’à des heures après la dernière dose . Ceci est probablement dû au fait que la plupart des tests de validation pour les échantillons de sérum se sont concentrés sur le contrôle des niveaux de toxicité des médicaments. signaler le plus court intervalle après le traitement que l’antibiotique peut être détecté aussi court que minutes

Limites inférieures de détection

Presque toutes les méthodes publiées considèrent que toute zone d’inhibition autour du disque de papier filtre indique une activité antibiotique. Une étude a pu corréler la taille des zones d’essai biologique urinaire avec le temps approximatif écoulé depuis le dernier traitement à la pénicilline. l’antibiotique et l’organisme indicateur, variant largement de & lt; À μg d’antibiotique par millilitre de spécimen Dans les échantillons de sérum et d’urine, le chloramphénicol a toujours une sensibilité plus faible et nécessite des concentrations plus élevées à détecter par rapport aux autres antibiotiques [,,,]

PROCÉDÉS DE BIOESSAY DE DÉTECTION D’ANTIBIOTIQUES POUR PERCH

PERCH utilisera le test de diffusion de disque pour la détection de l’activité antibiotique en raison de sa facilité d’utilisation, son faible coût et sa capacité à détecter largement le prétraitement antibiotique. La méthode de diffusion du disque sera également utilisée pour tester la sensibilité aux antibiotiques des isolats. Les méthodes de l’essai biologique antibiotique seront normalisées dans tous les laboratoires du site PERCH. Nous utiliserons des disques de papier filtre de mm et une suspension McFarland de la souche S aureus ATCC dans du sérum physiologique normal comme organisme indicateur, qui a été choisi parce que il est couramment utilisé et facile à acquérir. La suspension sera striée sur une plaque de gélose Mueller-Hinton avec un tampon stérile. Ensuite, μL du fluide corporel sera appliqué avec une pipette sur le disque de papier filtre, qui sera ensuite placé sur le plaque d’agar striée L’incubation se fera pendant la nuit – heures à ° C – ° C, et toute zone d’inhibition sera interprétée comme un résultat positif Les disques de sensibilité aux antibiotiques seront utilisés comme contrôles positifs et les disques inoculés avec une solution saline stérile serviront de contrôles négatifs. Ils seront inclus dans chaque plaque. Les échantillons provenant des participants au contrôle seront testés selon les mêmes méthodes et dans les mêmes conditions. prévoir de tester les échantillons de sérum, mais aussi tester les échantillons d’urine si les taux de collecte d’urine sont élevés

CONCLUSIONS

Plus de quelques années après avoir été décrites dans la littérature, les bioessais par diffusion sur disque restent une méthode simple et peu onéreuse pour détecter la présence d’antibiotiques dans les échantillons sanguins et urinaires. Ces méthodes étant largement utilisées, il sera possible de comparer les résultats PERCH à l’activité antibiotique. résultats d’autres études Comme indiqué dans cette revue, le bioessai de diffusion de disque n’est pas sans limites. Les relations spécimen-organisme, organisme-antibiotique et spécimen-antibiotique ont toutes le potentiel d’influencer le test de manière inattendue En conséquence, faux Des résultats négatifs et faussement positifs ont été observés dans la littérature et ne peuvent souvent pas être expliqués La limitation la plus importante du test peut être la courte période de temps après la dernière dose d’antibiotique dans laquelle il peut détecter de manière fiable l’activité antibiotique dans le liquide corporel. Malgré ces limites, les études de validation analytique ont démontré que la méthode est fiable sous contr Dans des études de terrain, il a été démontré que cette étude fournit des informations précieuses en conjonction avec les rapports des parents sur le prétraitement des antibiotiques

Remarques

Aide financière

Ce travail a été soutenu par une subvention de The Bill & amp; Fondation Melinda Gates au Centre international d’accès aux vaccins, Département de la santé internationale, École de santé publique Johns Hopkins Bloomberg

Supplément de parrainage

Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé «Pneumonia Etiology Research for Child Health», parrainé par une subvention de The Bill & amp; Fondation Melinda Gates au projet PERCH de l’école de santé publique Johns Hopkins Bloomberg, Baltimore, Maryland

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués